本文關(guān)鍵詞：RGD序列肽修飾的蠶絲人工韌帶在兔ACL重建中的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 將RGD多肽結(jié)合于絲素蛋白材料表面，實現(xiàn)對蠶絲韌帶的改性，提高BMSC的粘附與鋪展效率，并應用于實驗動物的前交叉韌帶重建實驗，為組織工程化蠶絲人工韌帶的進一步制備研究提供理論依據(jù)。 方法 取一周左右新西蘭大白兔骨髓間充質(zhì)干細胞，傳代培養(yǎng)并行流式細胞儀及免疫熒光檢測細胞種類。以EDC/NHS將絲素蛋白中的羧基活化，以PBS液配制的GRGDSPC對蠶絲韌帶進行表面修飾。取6根RGD序列肽修飾的蠶絲韌帶置于6孔板內(nèi)作為實驗組，同時取6根未經(jīng)修飾的蠶絲韌帶置于另一六孔板內(nèi)作為對照組，取第三代BMSCs細胞懸液均勻滴加于蠶絲韌帶上并置于細胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4h和12h后，分別通過消化法收集細胞懸液通過細胞計數(shù)板計數(shù)。 取第四代骨髓間充質(zhì)干細胞，人工蠶絲韌帶復合7天，形成BMSC-蠶絲韌帶復合材料。選取新西蘭大白兔36只（均經(jīng)檢疫合格），將其隨機分為三組(實驗組、對照組和空白組)，每組12只。實驗組應用RGD序列肽修飾的復合材料，對照組為未經(jīng)修飾的復合材料，空白組為單純蠶絲韌帶。各組均于無菌條件下重建右側(cè)前交叉韌帶。術(shù)后4W、8W、16W后取出移植物，分別行大體觀察、組織學及生物力學檢測。所得實驗數(shù)據(jù)均通過SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析。 結(jié)果 1、骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及鑒定 貼壁法分離并提純BMSCs，置于倒置顯微鏡下觀察，細胞貼壁生長，呈不規(guī)則梭形。免疫熒光檢測，結(jié)果顯示CD34陰性，CD44、CD50陽性，表現(xiàn)為干細胞特性。 2、人工蠶絲韌帶對BMSCs的粘附率 消化法測定細胞粘附率，結(jié)果顯示：4h時的粘附率實驗組0.26±0.05,對照組0.12±0.03, P0.01;12h時的粘附率實驗組0.46±0.04,對照組0.21±0.02，P0.01。經(jīng)RGD肽修飾的蠶絲韌帶粘附率明顯高于未經(jīng)修飾的蠶絲韌帶，通過t檢驗分析，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3、移植物取材觀察 術(shù)后4W，實驗組關(guān)節(jié)腔內(nèi)疏松結(jié)締組織生長較為明顯，韌帶局部被滑膜所包裹，韌帶兩端在骨道內(nèi)穩(wěn)定，切片顯示大量炎癥細胞，以粒細胞及淋巴細胞為主，韌帶本身可見少量彈性纖維在蠶絲束間出現(xiàn)。對照組關(guān)節(jié)腔內(nèi)疏松結(jié)締組織出現(xiàn)，不過韌帶表面滑膜包繞不明顯，切片見大批炎性細胞聚集，韌帶未見顯著性纖維長入�？瞻捉M韌帶表面無滑膜包繞，切片可見炎性細胞浸潤，韌帶未見明顯纖維長入。術(shù)后8W，實驗組關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜明顯增生并包繞韌帶，關(guān)節(jié)內(nèi)滑液清亮，部分致密結(jié)締組織長入韌帶，切片見炎癥細胞明顯減少，韌帶纖維結(jié)構(gòu)與蠶絲束結(jié)合緊密。對照組少量疏松結(jié)締組織與韌帶附著，外層滑膜包繞明顯，切片見炎癥細胞減少明顯，蠶絲束表面被少量結(jié)締組織包繞，未見血管結(jié)構(gòu)生長�？瞻捉M韌帶表面滑膜覆蓋不明顯，切片可見少量炎性細胞，未見明顯纖維結(jié)構(gòu)。術(shù)后16W，實驗組韌帶表面結(jié)締組織生長明顯，完全包繞韌帶，表面可見微小血管生長，滑膜豐富，關(guān)節(jié)內(nèi)滑液清亮，關(guān)節(jié)軟骨完好無磨損，切片見蠶絲束與致密結(jié)締組織緊密結(jié)合，纖維結(jié)締組織已長入蠶絲韌帶，微型血管出現(xiàn)。對照組韌帶部分被軟組織覆蓋，滑膜生長旺盛，切片蠶絲束表面可見有纖維結(jié)構(gòu)附著，未發(fā)現(xiàn)明顯血管結(jié)構(gòu)�？瞻捉M韌帶表面大部分由滑膜覆蓋，切片見少量結(jié)締組織包繞蠶絲束。各組取材后均行力學檢測，記錄所得最大抗拉強度值，結(jié)果顯示RGD肽修飾的蠶絲韌帶復合體的抗拉強度明顯高于未經(jīng)修飾的蠶絲韌帶復合體以及單純蠶絲韌帶，差別存在統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論 1、RGD肽與蠶絲韌帶復合后可明顯促進BMSCs的粘附與鋪展效率。 2、RGD肽修飾的蠶絲人工韌帶與BMSCs形成復合體，在膝關(guān)節(jié)微環(huán)境下能夠加快移植物韌帶化的趨勢。意義 近年來，韌帶損傷病例呈現(xiàn)增多趨勢，而相應重建手術(shù)隨之增多。在重建材料的探索中，蠶絲被認為是一種有前途的重建材料，近年來研究發(fā)現(xiàn)，蠶絲絲素材料擁有良好的生物相容性，突出的力學性能，而且能夠生物性降解，，滿足成為人工韌帶材料的所有特性，可以作為骨科組織損傷修復的一類材料。而這種材料也存在細胞粘附不良的缺點。本實驗中，通過在其表面共價接枝RGD肽，證明能提高BMSCs的粘附鋪展效率。在兔膝關(guān)節(jié)微環(huán)境下，RGD肽修飾的蠶絲韌帶表現(xiàn)出了比對照組和空白組明顯的優(yōu)勢，為探索組織工程化蠶絲人工韌帶的制備以及將來運用于臨床提供理論及實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：人工蠶絲韌帶 RGD肽 骨髓間充質(zhì)干細胞 前交叉韌帶
【學位授予單位】：泰山醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 符號說明10-11
• 前言11-15
• 材料與方法15-24
• 結(jié)果24-27
• 討論27-37
• 結(jié)論37-38
• 附圖38-43
• 參考文獻43-47
• 綜述47-56
• 參考文獻53-56
• 致謝56

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本文編號：308560