本文關(guān)鍵詞：人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞與仿生絲蛋白材料在皮膚組織工程中的運(yùn)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在大面積皮膚缺損的治療研究中,因可用于移植的白體皮膚有限,組織工程已經(jīng)成為了解決皮膚缺損修復(fù)的“良藥”,在臨床應(yīng)用方面有著廣闊的前景。尋找良好的種子細(xì)胞和支架材料是組織工程皮膚研究領(lǐng)域的兩大重要關(guān)鍵點(diǎn)。絲素蛋白(Silk Fibroin, SF)具有良好的生物學(xué)特性,如生物相容性、降解性、可塑性等,成為構(gòu)建組織工程皮膚的理想素材。種子細(xì)胞方面,人胎盤絨毛膜來源的問充質(zhì)干細(xì)胞(Chorion Mesenchymal Stem cells, CMSCs)具有來源方便,制取容易,增殖分化能力強(qiáng)等特點(diǎn),有作為皮膚組織工程種子細(xì)胞的潛力。因此,本論文選取絲素蛋白(SF)納米纖維材料為支架,CMSCs為種子細(xì)胞,重點(diǎn)研究SF材料對(duì)種子細(xì)胞CMSCs生物學(xué)特性的影響,探討CMSCs與仿生SF材料的生物相容性及其在皮膚損傷修復(fù)中的作用。第一部分人胎盤絨毛膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)與生物學(xué)特性鑒定目的：從人足月胎盤絨毛膜中分離絨毛問充質(zhì)干細(xì)胞(CMSCs),建立相應(yīng)的擴(kuò)增體系,并對(duì)CMSCs生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。方法：取健康產(chǎn)婦正常剖宮產(chǎn)足月胎兒的新鮮胎盤組織,鈍性分離羊膜層與絨毛膜層,對(duì)絨毛膜組織進(jìn)行消化及體外培養(yǎng),倒置顯微鏡觀察體外培養(yǎng)絨毛膜問充質(zhì)干細(xì)胞(CMSCs)的細(xì)胞形態(tài)；RT-PCR分析CMSCs中干細(xì)胞基因OCT4、 SOX2和NANOG的表達(dá)；流式細(xì)胞儀分別檢測其表面標(biāo)志；采用多種誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)CMSCs向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及骨細(xì)胞方向誘導(dǎo),并用特異性染色法對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果：(1)成功分離培養(yǎng)了CMSCs,體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中CMSCs呈典型的成纖維細(xì)胞樣貼壁生長,狀態(tài)良好且具有較快的增殖速度；(2)RT-PCR結(jié)果顯示,CMSCs表達(dá)干細(xì)胞特性基因OCT、SOX2和NANOG;(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測體外培養(yǎng)的CMSCs高表達(dá)CD90、CD73和CD105,不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34以及MHC-Ⅱ類分子HLA-DR;(4)體外擴(kuò)增培養(yǎng)的CMSCs成骨誘導(dǎo)后,細(xì)胞形態(tài)均由長梭形向立方形轉(zhuǎn)變,經(jīng)茜素紅S染色可見細(xì)胞集落生長并出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)；成軟骨誘導(dǎo)21天后,CMSCs在離心小管中團(tuán)聚形成小塊軟骨樣組織,經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后可見陽性細(xì)胞表達(dá)Ⅱ型膠原；成脂肪誘導(dǎo)2周后,培養(yǎng)的CMSCs細(xì)胞內(nèi)有明顯的脂滴出現(xiàn),油紅O染色陽性；CMSCs誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞21天后,在基質(zhì)膠上形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)。結(jié)論：通過酶消化成功獲取人CMSCs并在體外傳代擴(kuò)增,RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)及誘導(dǎo)分化結(jié)果提示獲得的CMSCs表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志分子并具有一定的多向分化能力,為組織工程提供良好的種子細(xì)胞。形態(tài)均由長梭形向立方形轉(zhuǎn)變,經(jīng)茜素紅S染色可見細(xì)胞集落生長并出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)；成軟骨誘導(dǎo)21天后,CMSCs在離心小管中團(tuán)聚形成小塊軟骨樣組織,經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后可見陽性細(xì)胞表達(dá)Ⅱ型膠原；成脂肪誘導(dǎo)2周后,培養(yǎng)的CMSCs細(xì)胞內(nèi)有明顯的脂滴出現(xiàn),油紅O染色陽性；CMSCs誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞21天后,在基質(zhì)膠上形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)。第二部分仿生絲素蛋白材料與絨毛間充質(zhì)干細(xì)胞間的相容性及其在修復(fù)皮膚損傷中的作用目的：研究仿生絲素蛋白納米纖維對(duì)CMSCs細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,并探索其在皮膚組織損傷修復(fù)中的作用。方法：以天然蠶絲納米原纖結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),通過溶液濃度實(shí)現(xiàn)靜電紡纖維直徑的有效調(diào)控,獲得不同納米尺度的靜電紡絲素蛋白纖維材料。應(yīng)用酶消化法從胎盤絨毛膜中提取CMSCs,并在體外培養(yǎng)和傳代擴(kuò)增后接種在不同直徑仿生絲素蛋白納米纖維材料上,培養(yǎng)不同時(shí)問后進(jìn)行檢測分析。分別采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的黏附生長及增殖情況,用CCK8法繪制生長曲線,采用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞鋪展及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),采用流式細(xì)胞儀檢測生長于SF材料上CMSCs的表型,通過以上測試分析揭示材料微納結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。選取利于細(xì)胞黏附生長維納結(jié)構(gòu)的SF材料,并制作不同疏密程度的SF材料后植入大鼠皮膚損傷處,觀察記錄創(chuàng)面修復(fù)情況并通過組織切片HE染色檢測材料在皮膚損傷修復(fù)中的作用。結(jié)果：(1)通過改變?nèi)芤簼舛戎谱鞒霾煌睆酱笮〉姆律鶶F納米纖維支架；(2)綜合運(yùn)用靜電紡絲技術(shù)、冷凍干燥技術(shù)、超聲波首次制取不同三維空間結(jié)構(gòu)的SF納米纖維材料；(3)CMSCs接種于仿生SF纖維材料后,細(xì)胞正常黏附生長和鋪展并有效增殖,流式細(xì)胞儀分析接種與仿生SF的CMSCs表型未改變,表明仿生SF納米纖維材料與CMSCs問具有優(yōu)異的生物相容性；(4)大鼠皮膚損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)表明,植入仿生SF材料的創(chuàng)面修復(fù)愈合程度更快更好的特性,并且無明顯的炎癥反應(yīng)。結(jié)論：不同直徑大小的仿生絲素蛋白材料與CMSCs具有良好的生物相容性,將其植入皮膚應(yīng)用于皮膚損傷修復(fù)的覆蓋填充物,為進(jìn)一步研究仿生絲素蛋白納米纖維材料在皮膚組織工程中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：人絨毛間充質(zhì)干細(xì)胞 生物學(xué)特性 分化 人絨毛間充質(zhì)干細(xì)胞 絲素蛋白納米纖維 皮膚損傷修復(fù)
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R318.08;R622
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-25
• 皮膚組織工程中的種子細(xì)胞13-16
• 皮膚組織工程支架材料16-19
• 小結(jié)19-20
• 參考文獻(xiàn)20-25
• 第一部分 人胎盤絨毛膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)與生物學(xué)特性鑒定25-38
• 一、材料和試劑25-26
• 二、實(shí)驗(yàn)方法26-29
• 三、結(jié)果29-32
• 四、討論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-38
• 第二部分 仿生絲蛋白材料與人絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞間的相容性及在皮膚損傷修復(fù)中的作用研究38-55
• 一、材料和試劑38-39
• 二、實(shí)驗(yàn)方法39-41
• 三、結(jié)果41-51
• 四、討論51-53
• 參考文獻(xiàn)53-55
• 結(jié)語55-57
• 小結(jié)55
• 創(chuàng)新性55-57
• 碩士學(xué)位學(xué)習(xí)期間發(fā)表的論文57-58
• 本課題的受資助情況58-59
• 英文縮寫詞表59-60
• 致謝60-62

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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  本文關(guān)鍵詞：人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞與仿生絲蛋白材料在皮膚組織工程中的運(yùn)用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：307553