目的對Ad-BMP-2/GFP轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）前后的生物學(xué)特性進行觀察。方法采用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離獲取第10代兔BMSCs,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原CD44、CD45、CD29的表達,用攜帶BMP2和GFP基因的腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。分別通過倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)改變,MTT法分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖的情況,體外Ⅰ型膠原免疫組化染色和鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色以觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的成骨分化情況,Western Blot檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)目的蛋白表達。結(jié)果密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法能獲取高純度第10代兔BMSCs,流式細(xì)胞儀檢測顯示CD44、CD29陽性,CD45陰性。Ad-BMP-2/GFP轉(zhuǎn)染兔BMSCs后在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,細(xì)胞形態(tài)向成骨方向分化,在短時間內(nèi)能促進兔BMSCs的增殖（P<0.05）,Ⅰ型膠原免疫組化染色、茜素紅染色均呈陽性,Western Blot顯示細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達BMP-2目的蛋白。結(jié)論 Ad-BMP-2/GFP能成功轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并能改變其生物學(xué)特性。 

【文章來源】：中國骨質(zhì)疏松雜志. 2014,20(12)北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

第10代兔BMSCs表面標(biāo)志物表達情況(CD29、CD44、CD45的陽性細(xì)胞分別占61.8%、93.6%、0.3%)

圖2兔BMSCs轉(zhuǎn)染后14天熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)(×200)。A:Ad-BMP-2/GFP組;B:Ad-GFP組Fig．2CellmorphologyofAd-BMP-2/GFPtransfectedBMSCsfor14daysunderthefluorescencemicroscope(×200)．A:Ad-BMP-2/GFPgroup;B:Ad-GFPgroup．圖3兔BMSCs轉(zhuǎn)染后21天倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)(×100)。A:Ad-BMP-2/GFP組;B:Ad-GFP組;Ad-BMP-2/GFP組見不透光的礦化結(jié)節(jié);Ad-GFP組細(xì)胞發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢Fig．3CellmorphologyofAd-BMP-2/GFPtransfectedBMSCsfor21daysundertheinvertedmicroscope(×100)．A:Ad-BMP-2/GFPgroup;B:Ad-GFPgroup．Ad-BMP-2/GFPgroupshowedopaquemineralizednodules;Ad-GFPgroupshowedcell-contactinhibitionandslowcellgrowth．象，而對照組細(xì)胞增殖旺盛，傳代較快，可見BMSCs成骨分化后，較未分化的BMSCs增殖速度減慢。圖4MTT檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增值動力學(xué)改變(*P＜0.05)Fig．4CellproliferationwasanalyzedusingMTTaftertransfection(*P＜0.05)2.4轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞成骨能力改變Ad-BMP-2/GFP組第14d細(xì)胞爬片，Ⅰ型膠原免疫組化染色呈陽性表達，細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒，大小形態(tài)均一，見圖5，第21d細(xì)胞爬片茜素紅染色后為紅色，見圖6。而未轉(zhuǎn)染組和Ad-GFP組Ⅰ型膠原免疫組化染色、茜素紅染色均呈陰性。2.5轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞目的蛋白表達檢測WesternBlot法檢測目的基因蛋白表達，化學(xué)發(fā)光法采圖見圖7，結(jié)果顯示Ad-BMP-2/GFP組檢測到約Mr30kD大小的陽性條帶，而Ad-GFP組及未轉(zhuǎn)染組可見較弱條帶。說明Ad-BMP-2/GFP轉(zhuǎn)染兔BMSCs后細(xì)胞在蛋白水平有高表達。3討論骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)已經(jīng)成為骨組織工程主要的種子細(xì)胞來源，由于其來源豐富，易于在體外分離培養(yǎng)，并具有自我更新和多系分化的能力，逐漸成為基因治療靶細(xì)胞

圖2兔BMSCs轉(zhuǎn)染后14天熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)(×200)。A:Ad-BMP-2/GFP組;B:Ad-GFP組Fig．2CellmorphologyofAd-BMP-2/GFPtransfectedBMSCsfor14daysunderthefluorescencemicroscope(×200)．A:Ad-BMP-2/GFPgroup;B:Ad-GFPgroup．圖3兔BMSCs轉(zhuǎn)染后21天倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)(×100)。A:Ad-BMP-2/GFP組;B:Ad-GFP組;Ad-BMP-2/GFP組見不透光的礦化結(jié)節(jié);Ad-GFP組細(xì)胞發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢Fig．3CellmorphologyofAd-BMP-2/GFPtransfectedBMSCsfor21daysundertheinvertedmicroscope(×100)．A:Ad-BMP-2/GFPgroup;B:Ad-GFPgroup．Ad-BMP-2/GFPgroupshowedopaquemineralizednodules;Ad-GFPgroupshowedcell-contactinhibitionandslowcellgrowth．象，而對照組細(xì)胞增殖旺盛，傳代較快，可見BMSCs成骨分化后，較未分化的BMSCs增殖速度減慢。圖4MTT檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增值動力學(xué)改變(*P＜0.05)Fig．4CellproliferationwasanalyzedusingMTTaftertransfection(*P＜0.05)2.4轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞成骨能力改變Ad-BMP-2/GFP組第14d細(xì)胞爬片，Ⅰ型膠原免疫組化染色呈陽性表達，細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒，大小形態(tài)均一，見圖5，第21d細(xì)胞爬片茜素紅染色后為紅色，見圖6。而未轉(zhuǎn)染組和Ad-GFP組Ⅰ型膠原免疫組化染色、茜素紅染色均呈陰性。2.5轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞目的蛋白表達檢測WesternBlot法檢測目的基因蛋白表達，化學(xué)發(fā)光法采圖見圖7，結(jié)果顯示Ad-BMP-2/GFP組檢測到約Mr30kD大小的陽性條帶，而Ad-GFP組及未轉(zhuǎn)染組可見較弱條帶。說明Ad-BMP-2/GFP轉(zhuǎn)染兔BMSCs后細(xì)胞在蛋白水平有高表達。3討論骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)已經(jīng)成為骨組織工程主要的種子細(xì)胞來源，由于其來源豐富，易于在體外分離培養(yǎng)，并具有自我更新和多系分化的能力，逐漸成為基因治療靶細(xì)胞

【參考文獻】：
期刊論文
[1]轉(zhuǎn)基因技術(shù)及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用與展望[J]. 陳佳濱,武成聰,李強,茹嘉,寧寅寬,蔡偉良.  臨床醫(yī)學(xué)工程. 2013(11)
[2]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用[J]. 林昭偉,李奇.  中國組織工程研究. 2012(49)
[3]骨組織工程中的檢測方法及其效果評估展望[J]. 程谷,李祖兵.  國際口腔醫(yī)學(xué)雜志. 2010(05)
[4]密度梯度離心與貼壁法相結(jié)合體外分離培養(yǎng)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞:1～3代細(xì)胞生長特性[J]. 潘華,王大偉,李紅波,張志偉.  中國組織工程研究與臨床康復(fù). 2007(42)



本文編號：3001718