本文關(guān)鍵詞：載小分子藥物Purmorphamine的絲素蛋白超細(xì)纖維的成骨誘導(dǎo)性能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：絲素蛋白(SF)是一種綜合性能優(yōu)良的天然生物材料,通過電紡技術(shù)將SF制備成超細(xì)纖維實(shí)現(xiàn)對(duì)天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的超微結(jié)構(gòu)仿生是當(dāng)前骨組織工程(BTE)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。電紡SF纖維結(jié)合具有再生特性的干細(xì)胞將有利于提高BTE方法修復(fù)骨缺損的再生功效,這需要提高支架的成骨誘導(dǎo)分化性能。Purmorphamine(PM)是一種新型的嘌呤衍生類小分子藥物,具有優(yōu)良的骨生成誘導(dǎo)活性。本論文主要目的是基于電紡SF仿生纖維,探討引入PM后SF基纖維的成骨誘導(dǎo)分化功效。為了檢測(cè)SF本身是否具有成骨誘導(dǎo)能力,本研究首先采用Na2CO3脫膠法從蠶繭中提取SF以及全骨髓貼壁法從大鼠體內(nèi)提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),并對(duì)提取的SF和BMSCs進(jìn)行分析鑒定,然后配制含不同SF濃度(0.01%、0.05%和0.1%)的培養(yǎng)基并對(duì)BMSCs進(jìn)行培養(yǎng),體外檢測(cè)這些SF溶液對(duì)BMSCs生長(zhǎng)、增殖和成骨分化的影響。結(jié)果表明:1)蠶繭提取樣品的FTIR光譜圖在1653、1530.5和1212.3 cm-1附近出現(xiàn)較明顯的吸收峰,分別為酰胺Ⅰ,酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ結(jié)構(gòu),由此可斷定提取物質(zhì)為SF。所提細(xì)胞對(duì)MSCs標(biāo)志物CD29,CD44,CD90的陽(yáng)性表達(dá)率分別為97.65%、99.01%和99.52%,對(duì)造血干細(xì)胞標(biāo)志物cd45的表達(dá)率為0.07%,且該細(xì)胞具有三系分化潛能,因此斷定所獲取的細(xì)胞為bmscs;2)0.05%濃度的sf溶液不僅能顯著促進(jìn)bmscs粘附、鋪展和增殖,還能夠促進(jìn)bmscs堿性磷酸酶(alp)的表達(dá),誘導(dǎo)bmscs向成骨細(xì)胞分化。本部分工作說明sf自身具有成骨誘導(dǎo)特性且誘導(dǎo)功效與其作用濃度有關(guān),sf可作為一種成骨誘導(dǎo)材料用于bte支架的構(gòu)建。接著,基于天然骨(密質(zhì)骨)骨膠纖維平行排列結(jié)構(gòu),本研究采用穩(wěn)定射流電紡技術(shù)(sjes)將sf制備成高度取向(含少量聚氧化乙烯peo)的超細(xì)sf纖維,并用甲醇水溶液對(duì)取向sf纖維進(jìn)行結(jié)構(gòu)改性,之后作水浸泡處理以瀝除纖維內(nèi)的peo成分。結(jié)果發(fā)現(xiàn):甲醇水溶液處理后,sf/peo纖維的力學(xué)性能得到明顯提高,但經(jīng)水處理瀝除peo后,纖維力學(xué)性能有所降低,親水性能則獲得提高。經(jīng)細(xì)胞相容性評(píng)估,發(fā)現(xiàn)甲醇改性后的纖維不僅具有良好的細(xì)胞相容性,還能調(diào)控細(xì)胞沿著纖維排列方向生長(zhǎng),并且瀝除peo的sf取向纖維更有利于細(xì)胞的粘附和鋪展。然后,對(duì)peo瀝除后的sf纖維與傳統(tǒng)電紡制備的無紡sf纖維的成骨誘導(dǎo)活性進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn):取向纖維雖然具有骨膠纖維的有序結(jié)構(gòu),能夠促進(jìn)bmscs的增殖,但卻不利于bmscs的alp表達(dá)。sf纖維的無序結(jié)構(gòu)更有利于促進(jìn)bmscs的成骨分化。基于以上結(jié)果,本研究接著在無紡sf纖維中引入具優(yōu)良生物相容性和骨傳導(dǎo)與骨誘導(dǎo)活性的羥基磷灰石(hap)制備hap/sf復(fù)合纖維,從力學(xué)性能方面評(píng)價(jià)hap的最佳添加量,然后評(píng)估該體系下hap/sf復(fù)合纖維的成骨誘導(dǎo)性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)hap能較好地分散在sf纖維中,并與sf的羧基基團(tuán)存在一定的化學(xué)鍵相互作用。10%的hap能夠顯著提高sf納米纖維的楊氏模量5.58倍,力學(xué)性能增強(qiáng)效果最佳,但親水性能有所下降;2)10%hap的加入不僅能夠提高bmscs的粘附、鋪展和增殖以及細(xì)胞對(duì)材料的趨附性,還能夠促進(jìn)bmscs的alp和膠原(col)蛋白的分泌,提高alp,col,骨鈣素(ocn)和骨粘連蛋白(on)的mrna表達(dá)水平,顯示出優(yōu)良的成骨分化誘導(dǎo)性能。最后,本研究引入pm以進(jìn)一步增強(qiáng)hap/sf復(fù)合纖維的成骨誘導(dǎo)分化功效,從蛋白和基因水平檢測(cè)pm/hap/sf復(fù)合纖維的成骨誘導(dǎo)活性并分析其作用機(jī)理。為了探索pm誘導(dǎo)bmscs成骨分化的最佳濃度,首先配制含不同pm濃度(0.1,3和10μm)的培養(yǎng)基對(duì)bmscs進(jìn)行培養(yǎng),并與常用成骨誘導(dǎo)劑體系(地塞米松、抗壞血酸和β-甘油磷酸鈉)的成骨誘導(dǎo)活性進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3μmpm的成骨誘導(dǎo)效果最佳,誘導(dǎo)功效與常用成骨誘導(dǎo)劑相當(dāng),說明pm可以很好的取代常用成骨誘導(dǎo)劑,用于bte支架的制備。然后,基于這一最佳濃度,對(duì)纖維中引入pm的最佳負(fù)載量進(jìn)行探索,并檢測(cè)不同pm濃度對(duì)纖維物理性能(如形貌、力學(xué)性能和親水性能等)、pm藥物釋放行為及細(xì)胞相容性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)pm的加入雖然有利于細(xì)化纖維直徑,但也會(huì)略微降低纖維力學(xué)性能和親水性能;2)纖維內(nèi)的hap組分對(duì)pm藥物釋放具有緩釋作用;3)pm的加入有利于促進(jìn)細(xì)胞的粘附、鋪展和增殖。最后,從蛋白和基因水平上評(píng)價(jià)細(xì)胞相容性有顯著性差異的兩個(gè)載藥纖維組別(10-PM/HAp/SF和20-PM/HAp/SF)誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的效能,并探索其誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化的作用機(jī)理,結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)PM與HAp誘導(dǎo)BMSCs成骨分化效果具有協(xié)同作用,共同促進(jìn)細(xì)胞ALP,COL,OCN和ON基因的表達(dá);2)10-PM/HAp/SF復(fù)合纖維主要通過激活Hedgehog信號(hào)通路來誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化�？傊�,本研究證實(shí)了SF自身就具有成骨誘導(dǎo)活性這一本質(zhì)特性,通過SJES制備了取向SF纖維對(duì)天然骨(密質(zhì)骨)進(jìn)行結(jié)構(gòu)仿生,發(fā)現(xiàn)其成骨誘導(dǎo)活性并不如無紡SF纖維。在無紡SF纖維中引入HAp,發(fā)現(xiàn)10%HAp/SF復(fù)合纖維的力學(xué)性能和成骨誘導(dǎo)活性都有顯著的提高。PM誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的最佳作用濃度是3μM,引入PM的PM/HAp/SF復(fù)合纖維可顯著提高對(duì)BMSCs的成骨誘導(dǎo)作用功效,且其可能主要是通過激活Hedgehog信號(hào)通路誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化。所有結(jié)果均表明PM/HAp/SF纖維可顯著誘導(dǎo)BMSCs成骨分化,具有優(yōu)良的生物相容性和成骨誘導(dǎo)活性,這為今后基于PM/HAp/SF纖維開展對(duì)體內(nèi)骨缺損的再生性修復(fù)評(píng)價(jià)工作奠定了基礎(chǔ),在BTE領(lǐng)域應(yīng)用前景誘人。
【關(guān)鍵詞】：骨組織工程 絲素蛋白 電紡絲 Purmorphamine 成骨分化
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R318.08;TQ340.64
【目錄】：

• 摘要5-9
• ABSTRACT9-15
• 第一章 緒論15-34
• 1.1 骨組織工程15-22
• 1.1.1 干細(xì)胞16-19
• 1.1.2 骨支架材料19-21
• 1.1.3 干細(xì)胞成骨分化的誘導(dǎo)方法21-22
• 1.2 絲素蛋白22-26
• 1.2.1 絲素蛋白概述22-24
• 1.2.2 絲素蛋白在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用24-25
• 1.2.3 絲素蛋白在骨組織工程中的應(yīng)用25-26
• 1.3 促進(jìn)骨修復(fù)的小分子藥物26-30
• 1.3.1 小分子藥物26
• 1.3.2 小分子藥物在骨組織工程中的應(yīng)用26-29
• 1.3.3 Purmorphamine簡(jiǎn)介及研究現(xiàn)狀29-30
• 1.4 本課題的提出、研究?jī)?nèi)容及創(chuàng)新性30-34
• 1.4.1 課題提出30-32
• 1.4.2 課題研究?jī)?nèi)容32-33
• 1.4.3 課題創(chuàng)新性33-34
• 第二章 SF的提取及SF溶液成骨分化性能的研究34-46
• 2.1 引言34-35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分35-39
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器35-36
• 2.2.2 SF的提取36-37
• 2.2.3 SF的形貌觀察和鑒定37
• 2.2.4 BMSCs的提取及培養(yǎng)37-38
• 2.2.5 SF溶液對(duì)BMSCs增殖的影響38
• 2.2.6 SF溶液對(duì)BMSCs體外成骨分化性能的影響38-39
• 2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析39
• 2.3 結(jié)果與討論39-45
• 2.3.1 SF的提取及表征39
• 2.3.2 BMSCs的提取、培養(yǎng)及鑒定39-41
• 2.3.3 SF溶液對(duì)BMSCs粘附及增殖能力的影響41-43
• 2.3.4 SF溶液誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化性能43-45
• 2.4 本章小結(jié)45-46
• 第三章 取向超細(xì)SF纖維的制備及成骨分化性能46-66
• 3.1 引言46
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分46-52
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器46-47
• 3.2.2 紡絲液的配制47-48
• 3.2.3 穩(wěn)定射流電紡絲48
• 3.2.4 超細(xì)取向SF纖維的改性及表征48-50
• 3.2.5 iPSC-MSCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)50-51
• 3.2.6 支架材料的預(yù)處理51
• 3.2.7 取向SF纖維體外細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)51-52
• 3.2.8 取向SF纖維的體外誘導(dǎo)BMSCs成骨分化性能52
• 3.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析52
• 3.3 結(jié)果與討論52-65
• 3.3.1 超細(xì)取向SF纖維的制備52-55
• 3.3.2 取向SF/PEO纖維的改性及表征55-60
• 3.3.3 iPSC-MSCs的誘導(dǎo)及培養(yǎng)60-61
• 3.3.4 取向SF纖維對(duì)iPSC-MSCs細(xì)胞行為的影響61-64
• 3.3.5 取向SF纖維誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化性能64-65
• 3.4 本章小結(jié)65-66
• 第四章 HAp/SF納米纖維的制備及成骨性能66-83
• 4.1 引言66
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分66-71
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器66-67
• 4.2.2 HAp/SF納米纖維的制備67
• 4.2.3 HAp/SF納米纖維的表征67-68
• 4.2.4 HAp/SF納米纖維體外細(xì)胞相容性68-69
• 4.2.5 HAp/SF納米纖維體外誘導(dǎo)BMSCs成骨分化69-71
• 4.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析71
• 4.3 結(jié)果與討論71-81
• 4.3.1 HAp/SF納米纖維的制備與表征71-75
• 4.3.2 HAp/SF納米纖維對(duì)BMSCs生長(zhǎng)行為的影響75-78
• 4.3.3 HAp/SF納米纖維誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化性能78-81
• 4.4 本章小結(jié)81-83
• 第五章 載PM的HAp/SF纖維的制備及成骨性能83-105
• 5.1 引言83-84
• 5.2 實(shí)驗(yàn)部分84-89
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器84
• 5.2.2 PM誘導(dǎo)BMSCs成骨分化性能的檢測(cè)84-86
• 5.2.3 PM/HAp/SF納米纖維的制備86
• 5.2.4 PM/HAp/SF納米纖維的表征86-87
• 5.2.5 PM/HAp/SF納米纖維的體外細(xì)胞相容性87-88
• 5.2.6 PM/HAp/SF納米纖維體外誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化性能88
• 5.2.7 PM/HAp/SF納米纖維誘導(dǎo)BMSCs成骨分化信號(hào)通路的研究88-89
• 5.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析89
• 5.3 結(jié)果與討論89-103
• 5.3.1 PM對(duì)BMSCs成骨分化性能的影響89-92
• 5.3.2 PM/HAp/SF納米纖維的制備及表征92-97
• 5.3.3 PM/HAp/SF納米纖維對(duì)BMSCs細(xì)胞行為的影響97-100
• 5.3.4 PM/HAp/SF納米纖維體外誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化性能100-102
• 5.3.5 PM/HAp/SF納米纖維誘導(dǎo)BMSCs成骨分化信號(hào)通路的檢測(cè)102-103
• 5.4 本章小結(jié)103-105
• 第六章 結(jié)論和展望105-108
• 6.1 本文主要結(jié)論105-106
• 6.2 展望106-108
• 參考文獻(xiàn)108-120
• 攻讀碩士期間科研與獲獎(jiǎng)情況120-122
• 致謝122-123

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本文編號(hào)：296707