發(fā)布時(shí)間：2017-04-08 09:18

  本文關(guān)鍵詞：新型自組裝多肽支架對(duì)小鼠MSCs的粘附、增殖及成骨效應(yīng)的體外研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨移植是一種臨床上常用的修復(fù)骨缺損的方法。自體骨移植雖然是修復(fù)骨大段缺損的金標(biāo)準(zhǔn),但受到供體骨來源不足、造成新的骨缺損和疼痛等缺點(diǎn)的限制。骨組織工程的迅速發(fā)展,為骨缺損的修復(fù)帶來了新的選擇。目前,骨組織工程三要素之一的支架材料成為研究的熱點(diǎn)。多種支架材料的出現(xiàn)為修復(fù)骨缺損提供了更多的選擇,但在研究中也發(fā)現(xiàn)這些支架材料尚有很多不足:同種異體骨具有天然骨組織結(jié)構(gòu),但可能引發(fā)免疫反應(yīng)、傳播疾病;人工合成修復(fù)材料可大量生產(chǎn),但存在材料表面親水性差,細(xì)胞不易粘附,缺乏成骨誘導(dǎo)性能等缺點(diǎn)。自組裝多肽由人工合成,成分是氨基酸,在水中溶解時(shí)自發(fā)組裝成納米纖維并相互搭載形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。纖維直徑10~20nm,孔徑5~200nm,含水量超過99%。向自組裝肽溶液中加入鹽離子可以使其迅速形成水凝膠。這種水凝膠支架的優(yōu)勢(shì)有:1、水凝膠有著與細(xì)胞外基質(zhì)類似的微環(huán)境,利于細(xì)胞的粘附、增殖及分化;2、成分明確,降解產(chǎn)物是短肽或者氨基酸,生物相容性較好;3、有一定的可塑性。RADA16-Ⅰ是經(jīng)典的自組裝多肽,序列是Ac N-RADARADARADARADA-CONH2,已有多篇細(xì)胞附著生長(zhǎng)的文獻(xiàn)報(bào)道。最近,多名學(xué)者用不同的功能基序修飾RADA16-Ⅰ,研究發(fā)現(xiàn)這些新型功能化自組裝多肽構(gòu)建的水凝膠支架對(duì)細(xì)胞的粘附、增殖和分化有良好的促進(jìn)作用。Ⅰ型膠原來源的DGEA(Asp-Gly-Glu-Ala)序列能夠作用于α2β1整合素受體,對(duì)細(xì)胞粘附有促進(jìn)作用。基于以上基礎(chǔ),我們將DGEA基序用固相合成法同RADA16-Ⅰ的C端結(jié)合,得到新的功能化自組裝多肽RAD-DGEA,序列是Ac N-RADARADARADARADA-GG-DGEA-CONH2,但在觀察其微觀結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)它只能形成短的纖維并且相互之間不搭載。將RADA/DGEA與RADA16-Ⅰ等比混合配制成DGEAmx,發(fā)現(xiàn)DGEAmx可以形成與RADA16-Ⅰ類似的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。我們將C57小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在空白玻片、RADA16-Ⅰ水凝膠和DGEAmx水凝膠這3組材料上進(jìn)行培養(yǎng),并檢測(cè)細(xì)胞的粘附、增殖和分化情況,以期得到一種理想的骨修復(fù)支架材料。目的:⑴觀察自組裝多肽的微觀結(jié)構(gòu);⑵檢測(cè)細(xì)胞在材料上的粘附率;⑶檢測(cè)細(xì)胞在材料上的增殖情況;⑷檢測(cè)成骨細(xì)胞分化指標(biāo)堿性磷酸酶(alp)活性、細(xì)胞間粘附分子-1(icam-Ⅰ)、骨鈣蛋白(ocn)的表達(dá)以評(píng)價(jià)成骨效果。方法:⑴原子力顯微鏡觀察(afm)自組裝多肽的微觀結(jié)構(gòu):將自組裝多肽配制成肽溶液,稀釋后將多肽溶液滴加在新剝離開的云母片表面,待干燥后在原子力顯微鏡下觀察多肽的微觀結(jié)構(gòu)。⑵鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞在材料上的粘附率:在24孔板內(nèi)放置無菌蓋玻片并將自組裝多肽溶液滴加在玻片上,加入培養(yǎng)基使其成膠。將小鼠mscs懸液加入培養(yǎng)孔。在加入細(xì)胞懸液后的10、30、60、90min時(shí)分別對(duì)各組材料上粘附的細(xì)胞拍照并隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。⑶cck-8法對(duì)比細(xì)胞在材料上的增殖情況:細(xì)胞培養(yǎng)在各組材料表面,在培養(yǎng)的第1、3、5、7天用cck-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖。⑷細(xì)胞骨架檢測(cè):在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的第3、7、14天時(shí)用鬼筆環(huán)肽和dapi為細(xì)胞骨架和細(xì)胞核染色,激光共聚焦鏡下觀察并拍照。⑸檢測(cè)成骨細(xì)胞分化指標(biāo)堿性磷酸酶活性、細(xì)胞間粘附分子-1、骨鈣蛋白的表達(dá)以評(píng)價(jià)成骨效果:將細(xì)胞在各組材料上成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),在培養(yǎng)的第3、7、14天時(shí)用堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)alp活性,real-timepcr檢測(cè)細(xì)胞間粘附分子-1和骨鈣蛋白。結(jié)果:⑴dgea肽不能形成纖維結(jié)構(gòu);rada16-Ⅰ可以形成均勻的長(zhǎng)纖維結(jié)構(gòu)并相互搭載成網(wǎng)狀;rad-dgea只能形成短的纖維結(jié)構(gòu),但當(dāng)rad-dgea與rada16-Ⅰ等比混合配制成的dgeamx可以形成類似于rada16-Ⅰ的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)afm結(jié)果,將后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料分為3組:空白玻片組,rada16-Ⅰ組,dgeamx組。⑵3組材料在不同時(shí)間點(diǎn)粘附細(xì)胞數(shù)經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,在第10min時(shí),各組間沒有顯著性差異(p0.05);而在第30、60、90min時(shí)各組粘附細(xì)胞數(shù)之間分別有顯著性差異(p0.05)。⑶細(xì)胞在3組不同材料上的增殖情況,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,在培養(yǎng)1天時(shí),各組之間沒有顯著性差異(P0.05);在培養(yǎng)3天時(shí),DGEAmx組高于空白組(P0.05);在培養(yǎng)5天時(shí),各組間分別有顯著性差異(P0.05);在培養(yǎng)7天時(shí),DGEAmx組高于其他兩組(P0.05)。⑷共聚焦顯微鏡下觀察,在不同時(shí)間點(diǎn)相同倍數(shù)下DGEAmx組有更高的細(xì)胞數(shù)量,并且細(xì)胞鋪展完全,可以觀察到粗大的細(xì)胞骨架。⑸在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的3、7、14天時(shí),比較3組材料上的細(xì)胞ALP活性,3組之間分別有顯著性差異(P0.05);比較3組材料上ICAM-Ⅰ和OCN的表達(dá),DGEAmx組均高于其他兩組(P0.05)。結(jié)論:支架材料作為骨組織工程的三要素之一,在性能方面有著諸多要求。自組裝多肽作為一種人工合成的材料,擁有能夠批量生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)。其形成的水凝膠有著類似于天然的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的結(jié)構(gòu),具有較高的含水量和孔隙度,是適合細(xì)胞附著和生長(zhǎng)的載體。其合成材料是氨基酸,降解產(chǎn)物無毒性,能避免炎癥和免疫反應(yīng)。本研究用固相合成法將功能基序DGEA加入RADA16-Ⅰ并構(gòu)建了DGEAmx水凝膠,觀察了自組裝多肽的微觀結(jié)構(gòu)并對(duì)細(xì)胞在多肽水凝膠表面的粘附、增殖和分化進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明DGEAmx水凝膠是適合細(xì)胞體外培養(yǎng)的新型支架材料,作為骨組織工程修復(fù)材料有著較好的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：骨組織工程 自助裝多肽 水凝膠 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 納米纖維
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定15-25
• 2.1 引言15-16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料16-17
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法17-20
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-23
• 2.5 討論23-25
• 第三章 功能化自組裝多肽水凝膠支架的構(gòu)建25-32
• 3.1 引言25-26
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料26
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法26-27
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-29
• 3.5 討論29-32
• 第四章 功能化自組裝多肽水凝膠支架對(duì)小鼠MSCs粘附、增殖及成骨分化的影響32-45
• 4.1 引言32-33
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料33-35
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法35-39
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-43
• 4.5 討論43-45
• 全文總結(jié)45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 文獻(xiàn)綜述 自組裝多肽水凝膠支架在骨組織工程中的應(yīng)用50-57
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果57-58
• 致謝58

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