發(fā)布時間：2020-09-19 15:24

　　 引導骨組織再生(Guide bone regeneration, GBR)是近年發(fā)展起來的一項促進組織再生愈合的新理論和新技術。它指利用膜的機械屏障作用,阻止病損區(qū)周圍生長較快的其它組織細胞長入病損區(qū),消除其它組織細胞的競爭性抑制作用,選擇性引導特定細胞向病損的部位附著、增生,促進病損的修復。近年,種子細胞和生物活性因子的加入,復合化和功能化的GBR膜具有更好的引導骨組織再生作用。目前以天然衍生牛心包為基礎制備復合功能GBR膜的研究較少,本研究分四個部分,首先以天然牛心包為來源通過脫細胞處理和交聯(lián)處理制備出符合引導骨組織再生技術要求的天然衍生GBR膜；第二部分進行骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)不同方向誘導培養(yǎng)和BMP-2基因轉染BMSCs實驗研究,為下一步復合GBR膜的研究打下基礎；第三部分將天然衍生脫細胞牛心包膜與BMP-2基因轉染的BMSCs體外復合,檢測其生物相容性和細胞增殖等情況,為下一步動物實驗打下基礎；第四部進行天然衍生脫細胞牛心包膜復合BMP-2基因轉染的BMSCs引導骨組織再生的初步動物實驗研究,探討脫細胞牛心包膜復合BMP-2基因轉染的BMSCs臨床上引導骨組織再生、修復骨缺損的可行性。 第一章天然衍生脫細胞牛心包膜的制備 目的：篩選出一種比較理想的天然衍生牛心包脫細胞處理和交聯(lián)處理方法,為制備出符合臨床要求的GBR膜材料打下基礎。 方法： 1.天然牛心包膜采用胰酶去垢劑法(Ⅰ),胰酶核酸酶法(Ⅱ),胰酶去垢劑核酸酶聯(lián)合法(Ⅲ),凍融后去污劑法(IV),凍融后核酸酶法(V),凍融后去污劑核酸酶聯(lián)合法(Ⅵ)進行脫細胞處理,通過光鏡、掃描電鏡觀察,細胞毒性實驗,機械性能測定,細胞趨化性實驗等,篩選出最佳脫細胞處理方法。 2.天然衍生脫細胞牛心包膜采用戊二醛和京尼平對其進行交聯(lián)處理,通過光鏡、掃描電鏡觀察,厚度檢測,機械性能檢測,交聯(lián)指數(shù)測定,體外降解以及細胞毒性試驗等,篩選出最理想脫細胞牛心包膜交聯(lián)方法。 結果： 1.脫細胞結果表明：凍融去污劑核酸酶聯(lián)合法處理后牛心包纖維排列致密有序,天然結構保存良好,細胞毒性低,是最理想的脫細胞方法。 2.交聯(lián)結果表明：京尼平交聯(lián)脫細胞牛心包膜比戊二醛交聯(lián)效果具有更好生物相容性,交聯(lián)效果好,是最理想的交聯(lián)方法。 結論：凍融去污劑核酸酶聯(lián)合法是制備脫細胞牛心包膜最理想的方法；京尼平交聯(lián)的脫細胞牛心包膜具有更好生物相容性。 第二章骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)多向誘導培養(yǎng)及BMP-2基因轉染BMSCs實驗研究 目的：探索兔骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的分離培養(yǎng)方法并對BMSCs誘導,觀察其多向培養(yǎng)潛能；進行BMP-2基因轉染BMSCs實驗,為GBR復合膜研究打下基礎。 方法： 1.貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)兔BMSCs,相差顯微鏡觀察BMSCs的生長增殖情況；取生長狀態(tài)良好的第2代BMSCs,分別用成骨、成脂、成軟骨誘導培養(yǎng)基對其進行誘導培養(yǎng),然后檢測BMSCs多向培養(yǎng)生長情況。 2.傳代培養(yǎng)良好的BMSCs,通過質(zhì)粒載體,采用電穿孔法轉染BMP-2基因,然后進行下列鑒定：熒光顯微鏡觀察BMP-2轉染BMSCs生長增殖情況;RT-PCR檢測轉染細胞的BMP-2mRNA表達;Westeblot檢測BMP-2在蛋白水平的表達；ALP檢測評價其成骨分化能力。 結果： 1.兔原代及傳代BMSCs細胞生長良好；成骨誘導實驗ALP染色結果陽性,茜素紅染色陽性；成脂誘導實驗油紅O染色結果陽性；成軟骨誘導實驗Ⅰ型膠原和Aggrecan免疫化學染色陽性。 2.BMP-2轉染BMSCs的轉染效率為41.2士1.1%；RT-PCR結果表明BMP-2RNA表達陽性,Westernblot結果表明轉染BMSCs可有效表達轉染基因；BMP-2轉染的BMSCs的ALP活性明顯高于空白轉染組。 結論： 1.原代培養(yǎng)兔BMSCs具有多向生長能力,可成功誘導培養(yǎng)為脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞。 2.BMP-2基因可有效成功轉染BMSCs,從而為下步復合GBR膜研究打下基礎。 第三章脫細胞牛心包膜復合BMP-2轉染的BMSCs引導骨再生的體外實驗研究 目的：探討脫細胞牛心包復合BMP-2基因轉染的BMSCs材料的生物相容性,細胞毒性及BMSCs在牛心包膜材料上的貼附、生長、增殖及成骨分化情況。 方法：脫細胞牛心包膜體外復合BMP-2轉染的BMSCs,通過掃描電鏡評估細胞在脫細胞牛心包支架材料上的的貼附、生長與增殖情況,MTT檢測膜材料對轉染細胞的細胞毒性,ELISA檢測BMP-2含量,結晶紫染色法測定BMSCs細胞粘附能力檢測, ALP活性實驗檢測轉染BMSCs成骨性能。 結果： 1.掃描電鏡結果表明：脫細胞牛心包復合BMP-2基因轉染的BMSCs后,細胞能良好的貼附并增殖。 2.細胞毒性檢測結果表明,各組細胞的存活率沒有明顯差異。 3.細胞粘附能力檢測結果表明：脫細胞牛心包膜增強了BMP-2轉染BMSCs細胞粘附能力。 4.ALP活性檢測、Westernblot檢測和RT-PCR檢測結果表明：脫細胞牛心包膜增強了BMP-2轉染BMSCs向成骨細胞轉化的能力。 結論：脫細胞牛心包復合BMP-2基因轉染的BMSCs功能膜有良好的生物相容性和細胞相容性,可能具備更佳的引導骨再生能力。 第四章脫細胞牛心包膜復合BMP-2轉染的BMSCs引導骨再生的動物實驗研究 目的：將脫細胞牛心包復合BMP-2基因轉染的BMSCs構建的功能膜植入兔下領骨骨缺損處,探討其引導骨組織再生情況。 方法：建立兔下頜骨骨缺損模型,分別植入BMP-2轉染的BMSCs/脫細胞牛心包復合體(A組)、單純脫細胞牛心包材料(B組),同時設立空白對照(C組),分別于術后第4、8、12周行大體肉眼觀察,X線檢測和組織形態(tài)學檢測,觀察其成骨情況。 結果：大體肉眼觀察、X線檢測、組織形態(tài)學檢測結果表明：術后第8周及第16周實驗組A,B組骨缺損愈合情況與C組(空白對照)有顯著差異,且A組優(yōu)于B組(p0.05)。 結論：脫細胞牛心包復合BMP-2基因轉染的BMSCs功能膜可更加有效促進兔下頜骨骨缺損修復。
【學位單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R318.08
【部分圖文】：

原代BMSCs剛接種時，可見絕大多數(shù)

原代BMSCs培養(yǎng)7天，細胞分裂胞呈圓形漂浮于培養(yǎng)瓶中，少量細抱沉降到增殖并群落樣生長，可在培養(yǎng)瓶底見到多

【參考文獻】

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本文編號：2822678