【摘要】：目的:探討源于小鼠的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)體外定向分化為神經(jīng)元的方法,為大量穩(wěn)定地獲得神經(jīng)元及提供種子細(xì)胞治療脊髓損傷奠定體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:源于小鼠的iPSCs在不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中經(jīng)懸浮、貼壁、再懸浮和再貼壁培養(yǎng)。免疫熒光檢測(cè)iPSCs多能性標(biāo)志物、神經(jīng)干細(xì)胞及其分化細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)并行神經(jīng)元基因測(cè)序鑒定,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)iPSCs定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞及進(jìn)一步分化為神經(jīng)元的比例。結(jié)果:源于小鼠的iPSCs表達(dá)干細(xì)胞多能性標(biāo)志物Sox2、Oct4和SSEA1。懸浮培養(yǎng)可以形成類(lèi)球形擬胚體;經(jīng)誘導(dǎo)及機(jī)械分離后的細(xì)胞可形成神經(jīng)球,神經(jīng)球經(jīng)誘導(dǎo)后可分化為神經(jīng)元。免疫熒光顯示iPSCs可誘導(dǎo)出表達(dá)nestin的神經(jīng)球,貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)球可分化為分別表達(dá)微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)及髓磷脂堿性蛋白(MBP)的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。RT-PCR及基因鑒定結(jié)果顯示形成小鼠神經(jīng)元;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示分化細(xì)胞中神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)元的比例分別為63.93%±1.47%和21.40%±1.70%。結(jié)論:源于小鼠的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能夠穩(wěn)定地在體外定向分化為神經(jīng)元,為脊髓損傷的治療提供了一個(gè)可靠的細(xì)胞來(lái)源。
[Abstract]:Aim: to investigate the method of inducing pluripotent stem cells (induced pluripotent stem cells,iPSCs) derived from mice to differentiate into neurons in vitro, so as to provide in vitro experimental basis for the stable acquisition of neurons and the provision of seed cells for the treatment of spinal cord injury (sci). Methods: iPSCs derived from mice was cultured in different culture medium, such as suspension, adhesion, resuspension and reattachment. The expression of multipotent markers of iPSCs, neural stem cells and differentiated cell markers were detected by immunofluorescence. RT-PCR was used to detect the gene expression of neurons and glial cells. The proportion of iPSCs differentiated into neural stem cells and further differentiated into neurons was detected by flow cytometry. Results: iPSCs derived from mice expressed stem cell pluripotent markers Sox2,Oct4 and SSEA1.. Suspension culture can form globular embryoid body, and the cells after induction and mechanical separation can form neuronal spheres, which can be differentiated into neurons after induction. Immunofluorescence showed that iPSCs could induce the expression of nestin, and the adherent neurons could differentiate into neurons expressing microtubule-associated protein 2 (MAP-2), glial fibrillary acidic protein (GFAP) and myelin basic protein (MBP), respectively. The results of RT-PCR and gene identification of astrocytes and oligodendrocytes showed that mouse neurons were formed, and the percentages of neural stem cells and neurons in differentiated cells were 63.93% 鹵1.47% and 21.40% 鹵1.70%, respectively. Conclusion: the induced pluripotent stem cells derived from mice can stably differentiate into neurons in vitro and provide a reliable cell source for the treatment of spinal cord injury.
【作者單位】： 中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院脊柱外科;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31170947) 廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.S2012020011099;No.S2013010016413) 廣州市科技計(jì)劃(No.2013J4100062)
【分類(lèi)號(hào)】：Q813;R318

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本文編號(hào)：2202266