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趙莉等：ＰＬＧＡ的不同組成對支架材料性能的影響研究

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１．５降解實驗

別取材，做Ｍ１’ｒ增殖實驗，方法同上。該實驗每個時間將樣品裁成３ｃｍ×１．５ｃｍ的尺寸，浸泡于ｐＨ＝７．２點設(shè)４個平行對照孔。結(jié)果表示為平均值４－標(biāo)準(zhǔn)差，的磷酸鹽緩沖溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ

ｂｕｆｆｅｒｅｄｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＰＢＳ）

顯著性差異通過學(xué)生氏ｔ檢驗進(jìn)行判斷，以Ｐ＜０．０５為

中，然后置于真空干燥箱中反復(fù)抽真空，使樣品充分潤有統(tǒng)計學(xué)意義。

濕。將完全浸潤的樣品放置于六孔培養(yǎng)板內(nèi)，加入定１．６．３

總膠原含量總膠原含量是通過測定羥脯氨

量ＰＢＳ溶液，放入３７℃恒溫箱內(nèi)。于實驗后０，１，２，３，酸的含量來間接測定的。羥脯氨酸在膠原蛋白中占４，６，８，１０周取樣，去離子水沖洗，冷凍干燥后進(jìn)行重量１３．４％，在彈性蛋白中占極少量，其它蛋白中均不存損失、拉伸強(qiáng)度及ＳＥＭ檢測。

在，因此羥脯氨酸的量能反映結(jié)締組織疾病的膠原代

重量損失通過公式Ｌ＝（Ｗｏ－Ｗ。）／ｗｏ

Ｘ

１００％來計

謝情況。采用南京建成生物工程研究所的羥脯氨酸算，其中ｗｏ是降解前質(zhì)量，ｗ。是降解不同時間后的質(zhì)

（Ｈｙｐ）測試盒（Ａ０３０）來測定，其原理是樣品在氯化亞量。

錫的鹽酸溶液中水解，釋放出羥脯氨酸。羥脯氨酸在１．６細(xì)胞實驗

氧化劑的作用下產(chǎn)生的氧化物與對二甲氨基苯甲醛反原代培養(yǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)至５應(yīng)生成紫紅色化合物，根據(jù)其呈色的深淺可推算出其—１０代，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部時，，用０．２５％胰酶消化含量。

成２×１０６個／ｍｌ細(xì)胞懸液，按２

Ｘ

１０４／ｌ、／ｃｍ２的密度接

細(xì)胞一材料復(fù)合物處理前，進(jìn)行組織稱重，研磨后種于滅菌處理好的材料表面，待細(xì)胞黏附２ｈ后，加入于生理鹽水中勻漿，３５００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，取上清，稀足量的ＤＭＥＭ＋１０％小牛血清（ＦＢＳ）細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，釋后檢測液。按照試劑盒說明書方法消化，并設(shè)立標(biāo)隔天換液。

準(zhǔn)管及空白管�；靹颍叮啊嫠。保担恚椋�，冷卻后，３５００ｒ／１．６．１

細(xì)胞粘附樣品剪裁成ｌｃｍ×Ｉｃｍ的尺寸，經(jīng)

ｒａｉｎ離心ｌＯｍｉｎ，取上清液在５５０ｎｍ處，測各管吸光度。７５％的酒精浸泡，培養(yǎng)液浸潤后用于細(xì)胞接種。細(xì)胞接根據(jù)公式計算羥脯氨酸的含量。

種材料２Ａｈ后，每孔加入１００山５ｍｓ／ｍ１噻唑藍(lán)（３－（４，５一

１．６．４掃描電鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＳＥＭ）

ｄｉｍｃｔｈｙｌｔｈｉｏａｚｏｌ－２－ｙ１）－２，５一ｄｉｐｈｅｎｙｌ—ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，

觀察細(xì)胞一材料復(fù)合物培養(yǎng)３，７天后，用ＰＢＳ洗去ＭＹｒ）溶液，３７℃恒溫培養(yǎng)箱反應(yīng)４ｈ，將復(fù)合物移至新的殘余培養(yǎng)液，放入２．５％戊二醛溶液固定，鋨酸后固定，２４孔板，二甲基亞砜（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｆｆｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ）溶出材梯度乙醇脫水后，ｌ臨界點干燥，離子濺射儀噴金鍍膜

料上的細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶紫，在ＤＩＡｒｅａｄｅｒ（Ｅｌｘ

８００Ｇ，

后，在ＨｉｔａｃｈｉＳ－４５０掃描電鏡上觀察細(xì)胞的粘附和增

ＤＩＡＬＡＢ

ＧＭＢＨ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）上，以４９０ｈｍ波長測溶

殖情況。

出物吸光值。用已知濃度（０．２５

Ｘ

１０４

４＂／ｌＩｌｌ，０．５

Ｘ

１０４

４＂／ｍｌ，４×１０４ⅣｌＩｌｌ）培養(yǎng)

２

結(jié)果

爪／ｍｌ，１Ｘ１０４個／Ｉ【１１，２×１０４

２４ｈ的單層細(xì)胞測吸光值，得到細(xì)胞數(shù)．１吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過溶液澆注／顆粒瀝濾法制備出的ＰＬＧＡ支架，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出細(xì)胞在材料上的黏附率。該實驗重復(fù)孑Ｌ結(jié)構(gòu)均勻，孔徑在４０—２００１ＬＬｍ之間，連通孔徑較小，３次，每次實驗設(shè)４個平行對照孑Ｌ。

約在１０—４０１山ｍ之間。三種比例的ＰＬＧＡ支架在孑Ｌ結(jié)１．６．２細(xì)胞增殖在細(xì)胞接種材料后的１，３，５，７天分

構(gòu)上沒有差異（圖１）。

圖１三種不同比例的ＰＬＧＡ多孔支架的ＳＥＭ照片

Ｆｉｇ．１

ＳＥＭｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ

ｏｆｐｏｒｏｕｓＰＬＧＡｓｃａｆｆｏｌｄｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｉｔｉａｌｃｏｐｏｌｙｍｅｒ

ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ

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