本文關鍵詞：牛骨Ⅰ型膠原蛋白提取及結構表征，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

※工藝技術

食品科學

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牛骨Ⅰ型膠原蛋白提取及結構表征
劉麗莉 1 , 2 ，馬美湖 1 , * ，楊協(xié)力 2
(1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 摘 430070；2. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽

471003)

要：針對牛骨膠原蛋白提取的工藝( 脫脂、脫鈣、提取介質(zhì)) 和結構表征進行研究。結果表明：最佳的提取工

藝條件：采用乙醚低溫回流脫脂，0.48% 鹽酸脫鈣，骨粒徑為 5mm × 10mm ，以 1% 檸檬酸和 1% 胃蛋白酶復合 為提取介質(zhì)。純化后的牛骨膠原蛋白通過紫外掃描分析、FT-IR、DSC 熱收縮溫度和 SDS-PAGE 凝膠電泳的測定， 并與標準牛腱Ⅰ型膠原蛋白比較，確定所提蛋白為典型的Ⅰ型膠原蛋白，達到了電泳純，且較好地保持了Ⅰ型膠 原的 3 股螺旋結構。 關鍵詞： 牛骨；Ⅰ型膠原蛋白；提��；SDS-PAGE 電泳；差示掃描量熱法(DSC) ；傅里葉紅外光譜

Extraction and Characterization of Type Ⅰ Collagen from Bovine Bone
LIU Li-li 1,2，MA Mei-hu 1,*，YANG Xie-li 2 (1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China； 2. Department of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China) Abstract：In the present study, critical process steps for extracting type Ⅰ collagen from bovine bone, such as defatting, decalcification and extraction medium selection were optimized. Along with this, purified collagen was analyzed through SDSPAGE, UV, FT-IR and DSC, and compared with the standard of calf-tendon type I collagen. Results indicated that the optimal extraction process was based on low-temperature ethyl ether reflux defatting and decalcification of bovine bone powder with a particle size of 5 × 10 mm using 0.48% hydrochloric acid, followed by extraction using a mixed solution simultaneously containing 1% citric acid and 1% pepsin. The extracted collagen was identified as type I collagen and the purity reached electrophoretic grade. Furthermore, the unique triple helical structure of type I collagen remained very well. Key words：bovine bone；type Ⅰ collagen；extraction；SDS-PAGE；differential scanning calormetry (DSC)； Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) 中圖分類號：TS251 文獻標識碼：A 文章編號：1002-6630(2010)02-0087-05

膠原是很多脊椎動物和無脊椎動物體內(nèi)含量最豐富 的蛋白質(zhì)，占總蛋白質(zhì)量的 25% ～33% ，廣泛存在于動 物的皮膚、肌腱、骨骼中，其提取制品已廣泛應用于 醫(yī)藥、保健、食品加工、化妝品等眾多領域。迄今 為止，在遺傳學上已定義了 1 8 種獨特的膠原類型，其 中Ⅰ型膠原是骨、皮膚、筋鍵等的優(yōu)勢蛋白，占生物 體膠原總量的 9 0 % 。人們對Ⅰ型膠原的研究最多，其 在生物材料中的應用也最為廣泛 [1-3] 。 Ⅰ型膠原是動物體內(nèi)含量最多的一類膠原蛋白，其 在組織工程領域應用也最為廣泛。使得從動物組織內(nèi)提 �、裥湍z原成為近年的研究熱點。牛骨中含有豐富的Ⅰ

型膠原蛋白和鈣、磷等礦物質(zhì)，牛骨總質(zhì)量的 20%～30% 為蛋白質(zhì)，主要為膠原蛋白，可見牛骨是非常好的膠原 蛋白生產(chǎn)原料。目前國內(nèi)外對從牛骨肌腱和軟骨中提取 膠原蛋白的工藝已較成熟，并已運用于工業(yè)化生產(chǎn) [ 4-7] 。 而針對牛骨膠原蛋白的研究卻很少。我國牛骨的產(chǎn)量豐 富，為了更有效地促進畜產(chǎn)加工廢棄物的綜合利用、降 低骨骼加工的成本，開發(fā)新型膠原蛋白資源。本研究 考察牛骨膠原提取前處理工藝 ( 脫脂和脫鈣 ) ，并針對提 取的膠原蛋白進行相關的結構表征。 1 材料與方法

收稿日期：2009-03-04 基金項目： “十一五”國家科技支撐計劃項目 (2006BAD05A16) 作者簡介：劉麗莉 ( 1 9 7 4 — ) ，女，講師，博士研究生，主要從事生物技術與動物性食品科學研究。 E-mail：yangliuyilang@126.com * 通信作者：馬美湖 ( 1 9 5 7 — ) ，男，教授，博士，主要從事肉類、蛋品科學理論與技術研究。 E-mail：mameihuhn@yahoo.com.cn

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1.1

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材料與試劑 牛長骨購買于華中農(nóng)業(yè)大學菜市場。

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分沉淀，以 8500r/min 離心 20min ，用 0.5mol/L 的冰 醋酸重新溶解。重復鹽析一次，離心后得沉淀，再 用 0.5mol/L 冰醋酸溶解，于蒸餾水透析 2 ～3d ，每隔 4h 更換 1 次水，透析好后冷凍干燥得純膠原樣品。膠原蛋 白得率計算公式為：
純化所得的膠原蛋白的總質(zhì)量 膠原蛋白得率/%＝——————————————×100 牛骨蛋白質(zhì)的總質(zhì)量

甲叉雙丙烯酰胺 (Fluka 分裝 ) ；牛腱Ⅰ型膠原蛋白 ( 生化級， Sigma 分裝 )；高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標準品 (14000kD)；其他試劑( 均為分析純) 1.2 儀器與設備 Avanti J-E 超速冷凍離心機 公司；UV1800 紫外分光光度儀 470FT-IR 紅外光譜儀 差示掃描量熱儀 1.3 北京市六一儀器廠。 牛骨膠原蛋白的提取
[8-9]

北

京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；透析袋 國藥集團。

美國 Beckman Coulter 美國 MAPADA 公司； 1.4

牛骨基本成分的測定[10-11] 灰分：馬福爐法；粗蛋白質(zhì)：凱氏定氮法；粗脂

美國 Nicolet 公司；DSC204F1

德國 NETZSCH 公司；DYY-12 電泳儀

肪：索氏抽提法；膠原蛋白含量：采用分光光度法測 定原料骨中羥脯氨酸含量的方法。 1.5 法
[12]

鈣含量測定 骨料浸酸溶液中鈣含量的測定采用 E D T A 滴定 ：取浸酸溶液 1mL ，加水 9mL ，分別加入 3mL 三

實驗所有提取條件的選擇都以等量牛骨提取得到膠 原蛋白的質(zhì)量作為指標。由于膠原蛋白容易變性，實 驗操作都在 1 0 ℃左右進行。 1.3.1 成品 1.3.2 脫脂處理 破碎的牛骨經(jīng)水洗后，部分脂肪被洗掉，殘余的 脂肪分別采用不同的脫脂方法 ( 正己烷、石油醚及乙醚 靜置浸泡脫脂、乙醚低溫回流脫脂 )，確定最佳的方法。 脂肪殘留率 ( 殘油率 ) 的計算公式為： 脫脂后牛骨殘留的脂肪質(zhì)量 殘油率 /% ＝——————————————× 100 脫脂前的牛骨總脂肪質(zhì)量 1.3.3 脫鈣處理 采用稀鹽酸溶液脫除骨料中的鈣。研究不同的鹽酸 濃度(0.24、0.48、0.60mol/L)、粒徑(3mm × 5mm、5mm × 10mm、10mm × 15mm、15mm × 25mm) 對鈣溶出量 的影響，通過測定浸酸溶液中鈣離子的含量，確定合 適的浸酸脫鈣條件。脫鈣量的計算公式為：
鹽酸溶液中所含的鈣離子的總質(zhì)量 脫鈣量/(mg/mL)＝———————————————— 鹽酸的體積

乙醇 胺 和 5 m L 氨性 溶 液 ，兩滴 鉻 黑 指示 劑 ，以標 準 EDTA 溶液滴定到溶液由紫藍色轉(zhuǎn)為藍色。根據(jù)標準回 歸方程求解浸酸溶液中鈣含量。 1.6 牛骨膠原蛋白的結構表征[8-9,13-14] 紫外掃描分析：室溫條件下，以 0.5mo l/L 醋酸為 溶劑溶解膠原蛋白，樣品于紫外 - 可見光掃描儀上進行 200 ～300nm 波長范圍內(nèi)掃描。 紅外光譜分析：將一定量干燥后的 KBr 和冷凍干燥 后的膠原蛋白樣品置于瑪瑙研缽中，研磨均勻，盡量 成粉末狀，裝樣，手動壓片，取出樣品小心輕放入樣 品室。采用傅里葉變換紅外光譜儀對樣品在 4 0 0 ～ 4000cm -1 區(qū)間掃描。 熱收縮溫度的測定：采用差示掃描量熱法 ( D S C ) 。 稱取 5 ～6mg 樣品，放入 DSC 鋁坩鍋中，鋁坩鍋加蓋密 封后，以空鋁坩鍋作為參比。 25 ℃保持 1min ，從 25 ℃ 升溫到 120 ℃，升溫速率為 5 ℃/min ，120 ℃保持 1min 。 分子量的測定：采用 SDS-PAGE 垂直電泳法。15% 的分離膠、 5 % 的濃縮膠；電泳緩沖液為 T r i s - 甘氨酸 緩沖液 (pH8.3 ， 0.1% SDS)；樣品緩沖液為 0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl 緩沖液；0.25% 考馬斯亮蘭 R-250 甲醇水 染色液。采用直流恒壓電源，濃縮膠為 1 0 0 V ，分離膠 為 1 6 0 V ，電泳時間 3 ～ 4 h 。

提取工藝流程 牛長骨→修整、清洗→破碎→脫脂→脫鈣→純化→

1.3.4

提取介質(zhì)的選擇 將脫鈣牛骨粉碎后，采用不同的提取介質(zhì)為 0.5mol/L 2 2.1 結果與分析 骨料脫脂
表1 Table 1 處理 牛長骨(原料) 經(jīng)水洗骨 脫脂后骨 牛長骨的主要成分及質(zhì)量分數(shù) Main components of bovine bone 粗脂肪 /%(干基) 18.45 9.87 0.050 總灰分 /% 53.12 57.34 68.54

的醋酸、0.01mol/L 鹽酸、1% 檸檬酸 +1% 胃蛋白酶(m/V)， 料液比為 1:8(mg/mL) ，后于 4 ℃條件下提取 72h ，兩層 紗布過濾，濾液以 8500r/min 離心 20min ，得到酸溶性 膠原蛋白粗制液，比較提取效果。 1.3.5 膠原蛋白得率的測定 向粗制液中加入 NaCl 固體并不停攪拌，使?jié)舛冗_ 到 2mol/L ，然后在 4 ℃條件下靜置過夜，使膠原蛋白充

粗蛋白 /% 22.28 21.11 23.14

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牛長骨含有約 18.45% 的脂肪( 表 1) 。脂肪的存在明 顯影響提取膠原蛋白的品質(zhì)，同時可能使蛋白產(chǎn)生異 味。經(jīng)流動水清洗后的碎骨料采用不同方法脫脂，結 果見圖 1 。
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

由于化學反應速度受反應中濃度較小的底物所控 制。在鹽酸與鈣鹽的化學反應中，鹽酸的量相對較小 而磷酸鈣和碳酸鈣過量，因而反應受鹽酸的濃度控制。 根據(jù)文獻報道 [ 6 ] ，為了避免骨料中的有機成分遭到破 壞，鹽酸濃度選定為 0.24 ～ 0.60mol/L 。
14 12 10 8 6 4 2 0 1
0.24mol/L 0.48mol/L 0.60mol/L

殘油率 /%

A

B

C

D

E

F

處理方式 A . 原料骨；B . 水洗骨；C . 正己烷靜態(tài)浸泡；D . 石油 靜醚態(tài)浸泡；E . 乙醚靜態(tài)浸泡；F . 乙醚低溫回流。 圖1 Fig.1 碎骨料不同脫脂方法的效果比較 Fig.3 bovine bone

脫鈣量 /(mg/mL)

2

3

4

5

6

7

8

浸提次數(shù) 圖3 鹽酸濃度對骨脫鈣量的影響

Comparison of defatting efficiency of different methods on

Effect of HCl concentration on decalcification

由圖 3 可知，隨著浸酸液的更換，液體中鈣含量 從圖 1 可知，幾種脫脂方法都可使殘油率降低，但 降低的程度不同。正己烷、石油醚、乙醚浸泡脫脂盡 管使脂肪的殘油率下降的幅度較大，但耗時長達 4 8 h 。 而采用乙醚低溫回流脫脂，脫脂效果相當明顯，可以 使殘油率降低至 0.05% ，因此，最終選擇低溫乙醚回流 脫脂方法。 2.2 骨料脫鈣 脫脂后的骨料中無機礦物質(zhì)含量高達 68.54%，欲從 骨骼中獲得純膠原，需要除去骨料中的無機礦物質(zhì)。骨 料中的無機物主要是磷酸三鈣和碳酸鈣，由于鹽酸、磷 酸等可以與磷酸三鈣和碳酸鈣反應生成可溶性的鈣鹽而 游離出骨料，因此工業(yè)上普遍采用鹽酸、磷酸溶出骨 料中的無機物，這個過程稱為浸酸。本研究采用更換 鹽酸的辦法除去磷酸鹽。 以 E D T A 標準溶液滴定鈣標準溶液，得到滴定體 積 y (mL) 與鈣質(zhì)量濃度 x (mg/mL) 的關系，結果見圖 2 。 通過線性回歸得到標準方程為：y ＝ 1.016 x － 0.179( R 2 ＝ 0 . 9 9 9 8) ，由此關系式計算出脫鈣量。
60 50 40 30 20 10 0 － 10 0 EDTA 滴定的體積 /mL y ＝ 1.016x － 0.179 R2 ＝ 0.9998 脫鈣量 /(mg/mL) 20 15 10 5 0 2 4 6 8 時間 /h 圖4 骨粒徑對骨脫鈣量的影響 10 12 14
3×5 m m 5×10mm 10×15mm 15×25mm

逐漸減少，最終趨于平緩，浸酸接近終點；而且隨著 浸酸液鹽酸濃度越大，溶液中脫出鈣量也越大。將鹽 酸濃度 0.48mol/L 和 0.60mol/L 的脫鈣量相比較，兩者沒 有很大區(qū)別，且最終均趨于平衡，因此，從工業(yè)生產(chǎn) 考慮，選用 0.48mol/L 鹽酸濃度。 2.2.2 骨粒徑對脫鈣量的影響

Fig.4 Effect of particle size of bovine bone powder on decalcification

由圖 4 可知，骨鈣的溶出速度隨骨料粒徑的減小而 明顯增大。但當骨粒徑過小過細時反而容易在更換酸液 時隨廢液排出而損失。因此，實驗采用 5mm × 10mm 骨 粒徑。 2.3 提取介質(zhì)的選擇
表2 膠原蛋白提取介質(zhì)的選擇

10

20

30

40

50

Table 2

Comparison of collagen yield from bovine bone using different extraction media

鈣質(zhì)量濃度 /(mg/mL) 圖2 Fig.2 鈣離子滴定標準曲線 指標 膠原蛋白得率/%

0.01mol/L 鹽酸 2.8

0.5mol/L 醋酸 3.0

1% 檸檬酸 +1% 胃蛋白酶 5.6

Standard curve of calcium ion titration

2.2.1

鹽酸濃度對脫鈣量的影響

以膠原蛋白得率為指標考察提取介質(zhì)的影響，傳統(tǒng)

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的膠原蛋白所用的提取介質(zhì)為 0.01mol/L 鹽酸或 0.5mol/L 醋酸，本實驗選用 1 % 檸檬酸和 1 % 胃蛋白酶結合的方 法進行提取，結果見表 2 。 2.4 2.4.1 膠原蛋白結構表征 牛骨膠原蛋白的紫外光譜分析 將提取的膠原蛋白和牛腱Ⅰ型膠原蛋白樣品在紫外 可見光描儀上進行 200 ～ 300nm 波長范圍內(nèi)掃描，結果 見圖 5 。
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
提取牛骨 膠原蛋白 牛腱Ⅰ型 膠原蛋白

的牛骨膠原酰胺Ⅱ帶的特征吸收為 1545cm -1 。由于膠原 蛋白的甘氨酸和特征氨基酸羥脯氨酸和脯氨酸含量高， 且形成獨特序列(Gly-Pro-Hyp)n，使得膠原蛋白在 1200～ 1400cm -1 光譜內(nèi)具有其他蛋白所沒有的紅外光譜特征。 由 C — N 伸縮和 N — H 彎曲引起的酰胺Ⅲ帶出現(xiàn)在 1200～ 1360cm-1 譜帶，歸屬于 Gly 骨架和 Pro 側鏈的 CH2 搖擺振 動峰的體現(xiàn)。1238cm-1 為提取牛骨膠原蛋白 N — H 彎曲 引起的酰胺Ⅲ帶的特征頻率。 2.4.3 牛骨膠原蛋白熱收縮溫度的分析 在天然狀態(tài)下，，膠原是一個較剛硬的類棒狀分子， 它是由三條肽鏈纏繞成的一個超螺旋結構。它變性的結 果為形成三條肽鏈，而且成隨機卷曲狀態(tài)，因此膠原 的熱變性過程是在一個較窄的溫度間隔內(nèi)其三股螺旋的 解纏繞過程。膠原蛋白的熱變性溫度是反映其天然螺旋

吸光度

220 228 236 244 252 260 268 276 284 波長 /nm 圖5 Fig.5 牛骨酸溶性膠原蛋白紫外掃描圖 UV scanning spectra of extracted collagen of bovine bone and calf-tendon type I collagen standard

結構的一項重要指標，同時也反映膠原蛋白的生物活 性。當體系溫度達到 T s 時，膠原分子從伸展的纖維態(tài) 轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲狀。圖 7 將牛腱Ⅰ型膠原的 DSC 圖譜 與所提取膠原的 DSC 圖譜對比可以看出：兩者的熱變性 溫度 T s 分別為 69.1 ℃和 68.8 ℃，兩者基本接近，表明牛 骨膠原蛋白樣品較好的保持了膠原蛋白的三螺旋結構。
69.1℃

膠原蛋白所特有的吸收峰一般在 230nm 左右。由圖 5 可知，所提取的牛骨膠原蛋白和牛腱Ⅰ型膠原蛋白溶 液分別在 228nm 和 230nm 波長處有一個強吸收峰，符合 是氨基酸組成和結構存在一定差別。 2.4.2 牛骨膠原蛋白的傅里葉紅外分析
58 56 54 52 50 48 46 44 42 40 38 36 4000
牛腱Ⅰ型 膠原蛋白 提取牛骨 膠原蛋白

DSC/(mW/mg)

上述特性。但兩者最大吸收峰有些差別，可能的原因

0.28 0.26 0.24 0.22 0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 40 60 a.牛腱Ⅰ型膠原蛋白 溫度 /℃ 80

透光率 /%

2929.25

1545.44 1451.03 1397.94 1238.35

3000

2000 波數(shù) /cm
-1

1000

圖6 Fig.6

牛骨酸溶性膠原蛋白紅外掃描圖

FT-IR spectra of extracted collagen of bovine bone and calf-tendon type I collagen standard

0.28 0.26 0.24 0.22 0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 20 40

68.8℃

3330.40

1658.77

DSC/(mW/mg)

60 溫度 /℃

80

由圖 6 可知，牛骨膠原蛋白和牛腱Ⅰ型膠原蛋白的 紅外圖譜幾乎重合，說明兩者微觀結構有很大的相似 性。由此可以基本確定所提牛骨膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋 白。牛骨膠原蛋白在 3400cm -1 附近為酰胺 A ，呈現(xiàn)出蛋 白質(zhì)的特征吸收。由于大部分的膠原蛋白的酰胺Ⅰ帶在 1 6 5 0 ～ 1 6 5 5 c m - 1 ，實驗提取的牛骨膠原蛋白出現(xiàn)在 1653cm -1 ，說明牛骨膠原蛋白保留了大量的三股螺旋結 構。酰胺Ⅱ帶的特征吸收頻率為 1480 ～1600cm ，主要
-1

b.提取的牛骨膠原蛋白 圖7 牛骨膠原蛋白 DSC 曲線圖 Fig.7 DSC curves of calf-tendon type I collagen standard and extracted collagen of bovine bone

2.4.4

牛骨膠原蛋白的電泳分析 如圖 8 所示，從膠原的 SDS-PAGE 凝膠電泳圖譜可

以 清 晰 地 看 到 3 條 電 泳 帶 ， 從 上 到 下 依 次 為 β鏈 ( 約 210kD) 、 α1 鏈 ( 約 118kD) 、 α2 鏈 ( 約 110kD) ，圖譜上 無其他雜帶，可見所提膠原蛋白純度較高，達到了電

為膠原蛋白的 C — N 伸縮與 N — H 彎曲的反映，提取

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參考文獻：
[1]

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泳純。因此，推斷提取的膠原蛋白基本保持了完整的 三股螺旋結構。
β
1 200kD → 2

[2] [3]

α1
→ →

130kD

→

α2

[4]

97.4kD

→ [5]

1. 高分子質(zhì)量標準蛋白 Marker ；2. 提取牛骨膠原蛋白。 圖8 Fig.8 SDS-PAGE 凝膠電泳

[6]

SDS-PAGE profile of extracted collagen of bovine bone

[7]

3 3.1

結

論

[8] [9] [10] [11] [12] [13]

本實驗針對傳統(tǒng)提取膠原蛋白加以改進，確定了

提取牛骨膠原蛋白的工藝條件：脫脂采用乙醚低溫回流 抽提可以除去絕大部分脂肪，脂肪的殘留率為 0.05% ； 采用鹽酸脫鈣的條件為：0.48mol/L 鹽酸，骨粒徑為 5mm × 10mm，提取膠原的介質(zhì)為 1% 檸檬酸和 1% 胃蛋白酶 復合液。 3.2 通過紫外掃描、FT-IR 、DSC 和 SDS-PAGE 凝膠 電泳分析，與牛腱Ⅰ型膠原蛋白標準對照，確定所提 牛骨膠原蛋白為典型的Ⅰ型膠原蛋白，較好的保持了膠 原蛋白的三螺旋結構，且達到了電泳純。

[14]

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