【摘要】： 目的建立受四環(huán)素誘導表達外源基因Mst1的真核表達體系人胚腎293(HEK293)細胞株,用于進一步基因功能的研究。方法利用T-REx (Tetracycline - Regulated Expression)系統(tǒng)建立四環(huán)素可調(diào)控的表達體系。首先,構(gòu)建含有目的基因Mst1的質(zhì)粒pcDNA4/TO-Mst1。其次,將調(diào)節(jié)性pcDNA6/TR質(zhì)粒用脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞,經(jīng)藥物Blasticidin S篩選后的克隆用有限稀釋法進行單克隆化。單克隆擴增后再瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA4/TO-Mst1并用Zeocin篩選并挑選單克隆。然后經(jīng)四環(huán)素誘導表達,通過Western Blot方法檢測目的基因Mst1的表達水平,從而篩選出由四環(huán)素誘導的高表達外源基因Mst1的人胚腎293單克隆細胞株。結(jié)果通過T-REx系統(tǒng)成功構(gòu)建由四環(huán)素調(diào)控的高表達外源基因Mst1的人胚腎293細胞株。結(jié)論四環(huán)素誘導表達目的基因Mst1的人胚腎293細胞株可用于外源基因的真核調(diào)控表達,為研究目的基因Mst1及其它真核基因功能提供了一種有力的實驗手段。 目的探討四環(huán)素誘導性表達外源性Mst1(Mammalian sterile 20-like kinase 1)對HEK 293細胞增殖與凋亡的影響。方法在已經(jīng)成功構(gòu)建的四環(huán)素可誘導表達Mst1的HEK 293細胞系中,加入四環(huán)素誘導Mst1在HEK293細胞中高表達。通過蛋白Western Blot分析Mst1在HEK 293細胞中的表達情況;分別在加入四環(huán)素后12, 24,36,48小時通過四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT)觀察高表達Mst1后對細胞增殖的影響;加入四環(huán)素后36小時加入BrdU,通過其摻入比率來顯示Mst1對細胞增殖的影響;加入四環(huán)素后后36小時,加入順鉑作用14小時后通過Annexin V檢測其對細胞凋亡的影響。結(jié)果四環(huán)素成功誘導Mst1高表達;MTT及BrdU結(jié)果顯示在HEK 293細胞中高表達Mst1后細胞增殖明顯受到抑制;Annexin V檢測結(jié)果提示高表達Mst1后,細胞的凋亡率相對增高。結(jié)論在HEK 293細胞中高表達Mst1,不僅可以抑制細胞增殖,還可促進細胞凋亡。
[Abstract]:Objective to establish an eukaryotic expression system of human embryonic kidney 293 (HEK293) cell line which was induced by tetracycline to express exogenous gene Mst1 for further study of gene function. Methods T-REx (Tetracycline-Regulated Expression) system) was used to establish a tetracycline regulatory expression system. Firstly, the plasmid pcDNA4/TO-Mst1. containing the target gene Mst1 was constructed. Secondly, the regulatory pcDNA6/TR plasmid was transfected into human embryonic kidney 293 cells by liposome-mediated method, and the clone screened by drug Blasticidin S was monoclonal by limited dilution method. After amplification, the plasmid pcDNA4/TO-Mst1 was transiently transfected and Zeocin was used to screen and select the monoclonal. After tetracycline induced expression, the expression level of target gene Mst1 was detected by Western Blot method, and then the human embryonic kidney 293 cell line with high expression of exogenous gene Mst1 induced by tetracycline was selected. Results the human embryonic kidney 293 cell line was successfully constructed by tetracycline regulated by T-REx system with high expression of exogenous gene Mst1. Conclusion Tetracycline induced human embryonic kidney 293 cell line expressing the target gene Mst1 can be used to regulate the eukaryotic expression of exogenous gene, which provides a powerful experimental means for studying the function of the target gene Mst1 and other eukaryotic genes. Objective to investigate the effects of tetracycline induced expression of exogenous Mst1 (Mammalian sterile 20-like kinase 1 on proliferation and apoptosis of HEK 293 cells. Methods Tetracycline induced high expression of Mst1 in HEK293 cells was found in HEK 293 cell line which was successfully constructed by tetracycline induced expression of Mst1. The expression of Mst1 in HEK 293 cells was analyzed by protein Western Blot, and the effect of high expression of Mst1 on the proliferation of HEK 293 cells was observed by (MTT) assay. The effect of Mst1 on cell proliferation was demonstrated 36 hours after adding tetracycline and Annexin V by Annexin V at 36 hours after adding tetracycline and 14 hours after adding tetracycline. Results Tetracycline successfully induced the high expression of Mst1 and BrdU results showed that the proliferation of HEK 293 cells was significantly inhibited after high expression of Mst1. The results of Annexin V assay showed that the apoptosis rate of HEK 293 cells increased after the high expression of Mst1. Conclusion overexpression of Mst1, in HEK 293 cells can not only inhibit cell proliferation, but also promote apoptosis.
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R692;R346

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本文編號：2242722