研究背景:肌萎縮側(cè)索硬化癥(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是一種選擇性侵犯上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,引起進(jìn)行性癱瘓和肌肉萎縮的致命性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其臨床上主要表現(xiàn)為肌肉萎縮、無(wú)力,并出現(xiàn)腱反射亢進(jìn)、病理反射等,發(fā)病后進(jìn)行性加重,多因延髓麻痹、呼吸肌無(wú)力合并肺部感染而在發(fā)病后3～5年內(nèi)死亡。目前ALS的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,眾多實(shí)驗(yàn)顯示免疫炎癥反應(yīng)在ALS疾病的病理過(guò)程中起重要作用。在ALS疾病早期階段主要以保護(hù)性神經(jīng)免疫炎癥調(diào)節(jié)為主,機(jī)體通過(guò)釋放一些抗炎因子,如IL-4、IL-10和TGF-β等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在疾病進(jìn)展到中、晚期,以神經(jīng)毒性炎癥反應(yīng)占據(jù)主導(dǎo)地位,通過(guò)釋放各種炎癥因子TNF-α、IL-6,IL-1β等,損傷神經(jīng)元。目前由于ALS病因仍不清楚,發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,因此臨床尚缺乏有效的預(yù)防和治療措施。多數(shù)研究者主要從藥物治療、基因治療和干細(xì)胞治療3個(gè)方面探索有意義的治療方法。但是由于有效果的藥物極少,基因治療等在臨床試驗(yàn)的結(jié)果并不樂(lè)觀,因此,干細(xì)胞治療成為ALS目前最有前景的治療策略。同神經(jīng)干細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等相比,羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)具有來(lái)源充足,取材方便,無(wú)致瘤性,低免疫源性和免疫抑制作用等優(yōu)點(diǎn),并且具有更強(qiáng)的增殖能力及干細(xì)胞特性等,成為較為理想的免疫赦免細(xì)胞,因此,hAMSCs可能為ALS治療提供一種新的治療種子細(xì)胞,具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。本課題組前期研究表明,在轉(zhuǎn)基因ALS模型小鼠疾病早期階段即開(kāi)始給予多次hAMSCs靜脈移植具有治療作用,能延緩轉(zhuǎn)基因ALS模型小鼠的疾病進(jìn)展,改善其運(yùn)動(dòng)功能,減輕脊髓神經(jīng)炎癥反應(yīng),減少運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的丟失;hAMSCs與小膠質(zhì)細(xì)胞體外共培養(yǎng)時(shí),能夠明顯抑制其增殖和遷移能力,但具體機(jī)制仍不清楚。由于臨床大多數(shù)患者被確診時(shí)已處于疾病的中晚期階段,因此,在ALS疾病中、晚期階段給予hAMSCs移植治療,探索其治療作用及機(jī)制具有重要意義。因此本研究擬以ALS(hSOD1-G93A)轉(zhuǎn)基因模型小鼠為研究對(duì)象,將hAMSCs經(jīng)靜脈移植到疾病中、晚期轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi),從干細(xì)胞免疫炎癥調(diào)節(jié)的角度,探討hAMSCs對(duì)ALS轉(zhuǎn)基因小鼠的治療作用機(jī)制,從而為臨床治療ALS提供理論依據(jù)。目的:從干細(xì)胞免疫炎癥調(diào)節(jié)的角度,探討hAMSCs移植對(duì)ALS轉(zhuǎn)基因小鼠中晚期階段的治療作用及機(jī)制,從而為臨床治療ALS提供理論依據(jù)。方法:選取健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦志愿捐獻(xiàn)的新鮮羊膜,采用胰酶和膠原酶消化法及組織塊爬出法相結(jié)合的方法逐步分離純化羊膜間質(zhì)中的hAMSCs。將hSOD1-G93A半合子轉(zhuǎn)基因雄性配種小鼠與雌性同背景小鼠交配繁殖出子代小鼠,用PCR方法鑒定子代小鼠的基因型。將實(shí)驗(yàn)小鼠分為3組:hAMSCs治療組、PBS治療組和正常對(duì)照組,每組12只,在16周齡時(shí)各從尾靜脈注入約1×106個(gè)細(xì)胞(重懸于300μlPBS)或300μlPBS。在18周齡時(shí)分別取血、脾臟、脊髓(腰膨大)等組織,采用相關(guān)方法檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo),分析hAMSCs在免疫炎癥調(diào)節(jié)過(guò)程的作用及機(jī)制。結(jié)果:(1)經(jīng)ELISA檢測(cè),hAMSCs治療組血清中抗炎因子TGF-β等指標(biāo)均高于PBS治療組,炎癥因子TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6等指標(biāo)均低于PBS治,結(jié)果有差異,但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(2)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè),與PBS治療組相比,hAMSCs治療組小鼠脾臟、血液中Foxp3、Tregs、tDC等均升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。(3)經(jīng)免疫組化檢測(cè),hAMSCs治療組和PBS治療組脊髓組織內(nèi)ChAT、NeuN陽(yáng)性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量均低于野生型對(duì)照組,而hAMSCs治療組高于PBS組,但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);脊髓組織內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、Iba1在hAMSCs治療組和PBS治療組均高于野生型對(duì)照組,但PBS組高于hAMSCs治療組,但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。結(jié)論:在ALS疾病中晚期階段給予hAMSCs移植治療,體內(nèi)抗炎因子TGFβ有升高趨勢(shì),炎癥因子TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6等有降低趨勢(shì),淋巴細(xì)胞中Treg,tDC等指標(biāo)有升高趨勢(shì),提示hAMSCs在ALS疾病中晚期階段具有一定治療作用。但ALS疾病中晚期病情進(jìn)展迅速,難以逆轉(zhuǎn),在此階段實(shí)施干細(xì)胞治療,可能發(fā)揮的治療作用有限,因此難以達(dá)到明顯的療效。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R744.8
【部分圖文】：

圖３－ｌ．ｈＳＯＤｌ－Ｇ９３Ａ轉(zhuǎn)基因小鼠ＰＣＲ鑒定??泳道?Ａ：?ＤＮＡｍａｒｋｅｒ２０００；泳道２、５、８、１１、１２：?ｈＳＯＤｌ－Ｇ９３Ａ?基因陽(yáng)性；泳道?１、３、４、??６、７、９、１０：?ｈＳＯＤｌ－Ｇ９３Ａ?基因陰性??Ｆｉｇｕｒｅ３－１．?ＰＣＲ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｈＳＯＤｌ－Ｇ９３Ａ?ｍｏｕｓｅ．??ＬａｎｅＡ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ２０００；Ｌａｎｅ２、５、８、１１、１２：ｈＳＯＤｌ－Ｇ９３Ａｇｅｎｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｌａｎｅｌ、３、４、６、??７、９、１０：ｈＳＯＤｌ－Ｇ９３Ａｇｅｎ?ｎｅｇａｔｉｖｅ??

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！?４００?．?Ｉ?ｉ?＾?ｉ??（＊代表?Ｐ＜０．０５）??圖３－４．ＥＬＩＳＡ檢測(cè)血清炎癥因子結(jié)果圖??應(yīng)用ＥＬＳＩＡ方法檢測(cè)小鼠血清中ＩＬ－ｌａ的濃度，結(jié)果顯示移植ｈＡＭＳＣｓ組和移植ＰＢＳ組的??ｈＳＯＤｌ－Ｇ９３Ａ轉(zhuǎn)基因小鼠的濃度均高于野生型對(duì)照組小鼠；ｈＡＭＳＣｓ組與ＰＢＳ組相比，丨Ｌ－ｌａ??的濃度無(wú)明顯降低（統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)明顯差異，Ｐ＞〇．〇５）?；?ｈＡＭＳＣｓ組和野生型對(duì)照組相比，??４５??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2889705