發(fā)布時間：2020-06-06 14:39

【摘要】：背景(1)癲癇是一種常見的可致殘的腦部疾病,由多種原因導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元高度同步化異常放電所致,以反復發(fā)作的癇性發(fā)作為特點。目前全球癲癇患者數(shù)量達5000萬之多,其中約20-30%患者發(fā)展為耐藥性癲癇,需要終生藥物治療,且對藥物療效反應不佳,這給患者的身心健康、工作生活等一系列方面帶來嚴重影響,因次,癲癇已成為全社會關注的公共衛(wèi)生問題,迫切需要對其發(fā)作、發(fā)生、發(fā)展機制以及在此基礎上挖掘出的干預靶點進行研究。(2)癲癇發(fā)作過程伴有組織酸化,酸敏感離子通道(acid sensing ion channels,ASICs)是一種配體門控離子通道,當細胞外氫離子濃度升高時激活開放,所以該通道在癲癇發(fā)作中扮演了一定角色。但目前對酸敏感離子通道在癲癇發(fā)作中的作用尚不明確,有諸多爭議,特別是關于該通道是促癲癇發(fā)作還是抗癲癇發(fā)作,多方證據(jù)各執(zhí)一詞。酸敏感離子通道3(acid sensing ion channel 3,ASIC3)是該通道的亞基之一,它對酸性刺激最為敏感,開放過程中表現(xiàn)為雙相電流,亞基失活速度慢,保持開放時間長,因此最有可能對癲癇發(fā)作進行調控。目前,該亞基在癲癇發(fā)作方面的研究較少,值得深入挖掘。目的(1)本研究旨在探討癲癇發(fā)作動物模型和癲癇發(fā)作細胞模型中ASIC3的表達變化。(2)通過研究ASIC3對癲癇發(fā)作動物行為學的影響及相關的分子機制,為抗癲癇發(fā)作藥物研發(fā)提供新的思路和理論依據(jù)。方法(1)ASIC3在癲癇發(fā)作動物中的表達:采用氯化鋰-匹羅卡品癲癇發(fā)作大鼠模型,用蛋白印跡檢測不同時間點動物海馬區(qū)ASIC3的蛋白表達變化;用RT-PCR技術檢測不同時間點動物海馬區(qū)ASIC3的mRNA轉錄水平變化;用免疫組織化學檢測動物海馬區(qū)ASIC3的免疫染色強度。(2)ASIC3在癲癇發(fā)作細胞模型中的表達:培養(yǎng)新生大鼠海馬原代神經(jīng)元,采用免疫熒光染色鑒定純度;用無鎂外液誘導神經(jīng)元癲癇樣放電,并用膜片鉗技術予以證實;用蛋白印跡檢測神經(jīng)元癲癇樣放電后ASIC3的表達變化。(3)ASIC3對癲癇發(fā)作動物行為學的影響:采用氯化鋰-匹羅卡品癲癇發(fā)作大鼠模型,用ASIC3特異性阻斷劑APETx2進行側腦室注射,采用Racine評分評價動物癲癇發(fā)作潛伏期、最大發(fā)作強度、全身強直陣攣發(fā)作(Generalized tonic-clonic seizures,GTCS)比例以及發(fā)作強度隨時間的變化曲線。(4)ASIC3對癲癇發(fā)作影響的機制研究:在癲癇發(fā)作大鼠模型中,采用蛋白印跡檢測ASIC3 抑制后對 NMDA 受體(N-methyl-D-aspartate receptors,NMDARs)、AMPA受體(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors,AMPARs)各亞基表達的影響;用免疫共沉淀檢測ASIC3和NMDA受體、AMPA受體的相互作用;用蛋白印跡檢測NMDA受體下游信號通路鈣調蛋白依賴的蛋白激酶(calmodulin-dependent protein kinase-Ⅱ,CaMKⅡ)和環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)的變化情況;用膜片鉗檢測在無鎂外液誘導的癲癇發(fā)作細胞模型中ASIC3抑制后神經(jīng)元自發(fā)和誘發(fā)動作電位發(fā)放的變化,用膜片鉗檢測ASIC3抑制后海馬腦片中NMDA受體介導的微小興奮性突觸后電流(miniature excitatory postsynapticcurrent,mEPSC)和誘發(fā)興奮性突觸后電流(evoked excitatory postsynaptic current,eEPSC)的變化。結果(1)蛋白印跡檢測顯示,正常大鼠海馬組織有ASIC3的本底表達,癲癇發(fā)作2小時后表達水平即開始增高,24小時顯著升高,48小時到達平臺期,72小時略有降低;RT-PCR顯示,正常大鼠海馬組織有ASIC3的mRNA本底表達,隨著癲癇發(fā)作后時間推移,ASIC3的mRNA轉錄水平顯著增加;免疫組織化學顯示,正常大鼠海馬區(qū)ASIC3的免疫反應強度較弱,癲癇發(fā)作24小時后,免疫反應強度顯著升高。(2)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元經(jīng)過MAP-2免疫熒光染色鑒定純度較高;培養(yǎng)12-14天后,在電流鉗模式I = 0條件下進行全細胞模式記錄顯示,正常組海馬神經(jīng)元可見偶發(fā)的自發(fā)動作電位發(fā)放,而無鎂外液誘導3小時組可見密集的動作電位發(fā)放;無鎂外液誘導組神經(jīng)元ASIC3蛋白表達水平較正常組顯著升高。(3)側腦室注射ASIC3的抑制劑APETx2后,大鼠癲癇發(fā)作潛伏期顯著縮短,癲癇發(fā)作最大強度顯著增加,全身強直陣攣發(fā)作發(fā)生率顯著增加,在匹羅卡品注射后15分鐘、30分鐘、60分鐘時間點癲癇發(fā)作強度顯著高于假手術組,45分鐘時間點癲癇發(fā)作強度無顯著差異。(4)側腦室注射ASIC3的抑制劑APETx2后,大鼠癲癇發(fā)作后NMDA受體NR1、NR2A、NR2B亞基膜蛋白表達升高,而AMPA受體亞基GluR1膜蛋白表達未見明顯改變;ASIC3和NR1、NR2A、NR2B亞基之間存在蛋白相互作用,但和AMPA受體的GluR1亞基沒有相互作用;APETx2預處理顯著增加了大鼠癲癇發(fā)作后磷酸化CaMKⅡα蛋白和磷酸化CREB蛋白表達水平;AP5抑制NMDA受體功能后反轉了APETx2預處理引發(fā)的癲癇發(fā)作程度加劇。無鎂外液誘導的海馬神經(jīng)元經(jīng)過APETx2處理后自發(fā)動作電位和誘發(fā)動作電位發(fā)放數(shù)均增加;經(jīng)過APETx2預處理的癲癇發(fā)作大鼠腦片中NMDA受體介導的微小興奮性突觸后電流(miniature excitatory postsynaptic current,mEPSC)頻率和幅度增加,NMDA 受體介導的誘發(fā)興奮性突觸后電流(evoked excitatory postsynaptic current,eEPSC)也增加。結論(1)ASIC3在大鼠氯化鋰-匹羅卡品癲癇發(fā)作模型和無鎂外液誘導原代海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型中均表達升高。(2)抑制ASIC3加劇了氯化鋰-匹羅卡品癲癇發(fā)作模型中大鼠癲癇發(fā)作嚴重度,增加了無鎂外液中原代海馬神經(jīng)元興奮性。(3)抑制ASIC3加劇動物癲癇發(fā)作嚴重度與NMDA受體上調、NMDA受體下游CaMKⅡ和CREB信號通路激活以及突觸傳遞中NMDA受體介導的mEPSC和eEPSC增加相關。(4)ASIC3是機體自身抗癲癇發(fā)作的內(nèi)源性保護機制,加強ASIC3的功能可能成為防治癲癇發(fā)作的新途徑。
【圖文】：

鼠海馬組織有ＡＳＩＣ３的本底表達，癲癇發(fā)作２小時后ＡＳＩＣ３表達水平即開始增高（Ｐ＜逡逑０．０５），隨著時間推移，表達逐漸升高，２４小時顯著升高（Ｐ＜邋０．０１），４８小時至ＩＪ達平臺逡逑期，７２小時略有降低（圖１．１）。逡逑ａ邐ｂ邋２－°＇邐“ａ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｈ邋６ｈ邋２４ｈ邋４８ｈ邋７２ｈ邐ｃ＿邋１５．邐＊邋＾邋Ｍ｜邋Ｂ：邋Ｈ｜逡逑ＡＳＩＣ３邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜逡逑＿ｎＩＨＷｉＭＭｉ４２ｋＤａ＾°－５－邋ｌｌｌｌｌ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｈ邋６ｈ邋２４ｈ邋４８ｈ邋７２ｈ逡逑圖１．１蛋白印跡檢n,不同時間點大鼠海馬組織中ＡＳＩＣ３的蛋白表達情況（每組ｎ邋＝逡逑４，邋＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，和對照組相比）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｆｏｒ邋ＡＳＩＣ３邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ａｎｄ逡逑ｓｅｉｚｕｒｅ邋ｒａｔｓ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅ邋ｐｏｉｎｔｓ邋（＊Ｐ邋＜邋０．０５，邋＊＊Ｐ邋＜邋０．０１邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｇｒｏｕｐ）逡逑２．２邋ＲＴ－ＰＣＲ檢測ＡＳＩＣ３在vq癇發(fā)作動物模型海馬中的表達逡逑提取動物海馬組織總ＲＮＡ，逆轉錄成ｃＤＮＡ后，以此為模板進行ＡＳＩＣ３基因ＰＣＲ逡逑擴增，結果顯示，正常大鼠海馬組織有ＡＳＩＣ３的ｍＲＮＡ本底表達，癲癇發(fā)作后２小時逡逑至７２小時

鼠海馬組織有ＡＳＩＣ３的本底表達，癲癇發(fā)作２小時后ＡＳＩＣ３表達水平即開始增高（Ｐ＜逡逑０．０５），隨著時間推移，表達逐漸升高，２４小時顯著升高（Ｐ＜邋０．０１），４８小時至ＩＪ達平臺逡逑期，７２小時略有降低（圖１．１）。逡逑ａ邐ｂ邋２－°＇邐“ａ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｈ邋６ｈ邋２４ｈ邋４８ｈ邋７２ｈ邐ｃ＿邋１５．邐＊邋＾邋Ｍ｜邋Ｂ：邋Ｈ｜逡逑ＡＳＩＣ３邋｜邋｜邋｜邋｜邋｜逡逑＿ｎＩＨＷｉＭＭｉ４２ｋＤａ＾°－５－邋ｌｌｌｌｌ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｈ邋６ｈ邋２４ｈ邋４８ｈ邋７２ｈ逡逑圖１．１蛋白印跡檢n,不同時間點大鼠海馬組織中ＡＳＩＣ３的蛋白表達情況（每組ｎ邋＝逡逑４，，邋＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，和對照組相比）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｆｏｒ邋ＡＳＩＣ３邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ａｎｄ逡逑ｓｅｉｚｕｒｅ邋ｒａｔｓ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅ邋ｐｏｉｎｔｓ邋（＊Ｐ邋＜邋０．０５，邋＊＊Ｐ邋＜邋０．０１邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｇｒｏｕｐ）逡逑２．２邋ＲＴ－ＰＣＲ檢測ＡＳＩＣ３在vq癇發(fā)作動物模型海馬中的表達逡逑提取動物海馬組織總ＲＮＡ，逆轉錄成ｃＤＮＡ后，以此為模板進行ＡＳＩＣ３基因ＰＣＲ逡逑擴增，結果顯示，正常大鼠海馬組織有ＡＳＩＣ３的ｍＲＮＡ本底表達，癲癇發(fā)作后２小時逡逑至７２小時
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R742.1

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 梁倩云;展永;安海龍;龐春麗;;陰離子通道孔道結構研究進展[J];黑龍江科技信息;2017年08期

2 趙璐;蘇立;;心房顫動與離子通道重構研究進展[J];心血管病學進展;2015年05期

3 包春燕;賈慧娟;劉濤;汪奕;彭偉;朱麟勇;;雙分子層膜人工離子通道的合成[J];化學進展;2012年07期

4 周志涵;徐小娟;;流感病毒離子通道綜述[J];生物技術世界;2012年08期

5 尤江峰;鄭紹建;;植物體中的陰離子通道[J];植物營養(yǎng)與肥料學報;2006年02期

6 李泱;王士雯;;離子通道學的未來發(fā)展及可能遇到的問題[J];中國心臟起搏與心電生理雜志;2006年06期

7 ;細胞離子通道與疾病(2)[J];現(xiàn)代臨床醫(yī)學生物工程學雜志;2005年03期

8 ;細胞離子通道與疾病(3)[J];現(xiàn)代臨床醫(yī)學生物工程學雜志;2005年04期

9 葉萱;;植物離子通道農(nóng)藥潛在的作用靶標[J];世界農(nóng)藥;2005年05期

10 徐秀知,展永,紀青,安海龍,卓益忠;K~+離子通道及其研究進展[J];現(xiàn)代物理知識;2003年06期

相關會議論文 前10條

1 徐旭穎;王如彬;;離子通道參數(shù)對神經(jīng)元兩態(tài)切換影響的討論[A];中國力學大會-2015論文摘要集[C];2015年

2 徐天樂;;離子通道化學神經(jīng)生物學若干研究進展[A];第六屆全國化學生物學學術會議論文摘要集[C];2009年

3 徐天樂;;酸敏感離子通道非質子配體的發(fā)現(xiàn)[A];第十一次中國生物物理學術大會暨第九屆全國會員代表大會摘要集[C];2009年

4 李偉廣;于燁;曹慧;徐天樂;;酸敏感離子通道的化學調控與功能研究[A];中國生理學會第十一屆張錫鈞基金全國青年優(yōu)秀生理學學術論文交流及評獎會議綜合摘要[C];2011年

5 王世強;;離子通過離子通道的過程是擴散?[A];中國生理學會第十屆全國生理學教學研討會論文摘要匯編[C];2012年

6 徐鳳枝;;離子通道的選擇性與水化離子的脫水幾率[A];中國生物化學與分子生物學會第八屆會員代表大會暨全國學術會議論文摘要集[C];2001年

7 馬恒;裴建明;王躍民;周士勝;;陰離子通道在維持大鼠血管張力中的作用[A];中國生理學會第21屆全國代表大會暨學術會議論文摘要匯編[C];2002年

8 李潔;Reiner Salzer;周專;;人工非肽離子通道在類脂雙分子膜中重組的研究[A];第九次全國生物物理大會學術會議論文摘要集[C];2002年

9 陳建國;王芳;龍利紅;金悠;胡壯麗;;離子通道的氧化性調節(jié)[A];第十次中國生物物理學術大會論文摘要集[C];2006年

10 于生元;;疼痛與離子通道[A];中華醫(yī)學會疼痛學分會第七屆年會論文摘要集[C];2007年

相關重要報紙文章 前10條

1 李項;挫而不折!離子通道靶向藥開閘[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2019年

2 記者 耿挺;科學家利用線蟲構建離子通道[N];上海科技報;2018年

3 柯南;離子通道：不可能的任務[N];南方周末;2003年

4 董智;離子通道檢測新技術助推藥物研發(fā)[N];中國醫(yī)藥報;2010年

5 文執(zhí);離子通道探尋細胞之門[N];科技日報;2002年

6 記者 白毅;我學者離子通道研究獲得國際高度評價[N];中國醫(yī)藥報;2013年

7 通訊員 胡倩楠 記者 耿挺;中外科學家合作揭秘最大離子通道結構[N];上�？萍紙�;2016年

8 本報記者 陳怡;對話諾獎大師 探秘神奇細胞[N];上海科技報;2018年

9 生命學院;楊茂君、高寧、肖百龍合作《自然》發(fā)文揭示哺乳動物機械敏感離子通道冷凍電鏡結構[N];新清華;2015年

10 記者 耿挺;上海藥物所成功預測藥物與離子通道相互作用量-效關系[N];上�？萍紙�;2018年

相關博士學位論文 前10條

1 曹倩;酸敏感離子通道3在癲癇發(fā)作中的作用及機制研究[D];武漢大學;2018年

2 孫旭;鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ在多形性膠質母細胞瘤中對酸感受離子通道1的調節(jié)作用[D];哈爾濱醫(yī)科大學;2013年

3 張傳庚;蝎離子通道對毒素的抗性及新型毒素的功能研究[D];武漢大學;2016年

4 蔣進軍;水和離子通道在胸膜和肺部液體轉運中作用的實驗研究[D];復旦大學;2004年

5 李建萍;EAN大鼠神經(jīng)軸膜與淋巴細胞離子通道及雷公藤多甙干預的研究[D];復旦大學;2004年

6 李艷;TRPC離子通道在腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子介導的神經(jīng)元軸突轉向過程中的作用[D];中國科學院研究生院（上海生命科學研究院）;2005年

7 王維璽;東亞鉗蝎新型離子通道配體/調制劑的藥理結合及其病理研究[D];中國科學院研究生院（上海生命科學研究院）;2004年

8 文磊;新芋螺毒素SO-3鎮(zhèn)痛作用的離子通道機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2005年

9 李享元;基于離子通道動力學的神經(jīng)藥物作用機制的研究[D];華中科技大學;2005年

10 張彥莉;雙層類脂膜與離子通道分子自組裝性質的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2002年

相關碩士學位論文 前10條

1 徐燕;作用于ASIC1a通道的多肽毒素的篩選與鑒定[D];湖南師范大學;2018年

2 彭莎;電場驅動構建有序離子通道及其導電增強效應研究[D];江漢大學;2018年

3 陳曉磊;基于柱芳烴的人工單分子陰離子跨膜通道的設計合成[D];青島科技大學;2018年

4 劉娣;探討TRP離子通道和FKBP1B在蝙蝠冬眠中的重要作用[D];華東師范大學;2017年

5 張貝;作用于Nav1.5通道的印鼠客蚤多肽FS50結構與功能研究[D];南方醫(yī)科大學;2017年

6 林耀;基于雙親分子超分子自組裝的人工離子通道的設計合成[D];華東理工大學;2013年

7 賈慧娟;基于冠醚類衍生物的超分子自組裝人工離子通道的合成及其性質研究[D];華東理工大學;2012年

8 張永巖;離子通道隨機開關模型[D];湖南師范大學;2008年

9 馬恒;陰離子通道在維持大鼠血管張力中的作用[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學;2003年

10 姜河海;以離子通道為靶點的中草藥作用機制及活性成分初探[D];昆明理工大學;2016年

本文編號：2699827