【摘要】：腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)病死率致殘率高,是最具破壞的卒中類型。據(jù)一項(xiàng)2017年發(fā)表的全國性調(diào)查統(tǒng)計(jì)顯示,我國每年卒中的年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率為246.8/10萬人,其中ICH占了23.8%,遠(yuǎn)高于大多數(shù)西方國家。然而,ICH的致傷機(jī)制尚未完全明確,ICH后血腫的物理壓迫及繼發(fā)的血腫旁水腫(perihematomal edema,PHE)形成,均可影響患者預(yù)后。因此,及時(shí)清除血腫,以減輕原發(fā)和繼發(fā)損傷,在ICH治療中顯得尤為重要。然而,受血腫部位及手術(shù)本身創(chuàng)傷所限,開顱血腫清除術(shù)并不總適用。與傳統(tǒng)手術(shù)相比,微創(chuàng)手術(shù)聯(lián)合血腫腔內(nèi)纖溶藥物注射治療對(duì)正常腦組織創(chuàng)傷小,療效好,適用更廣,近年來得到關(guān)注并逐步發(fā)展起來,成為ICH較有前景的治療措施。目前,該措施中最廣泛使用的纖溶藥物是阿替普酶,即組織型纖溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator,tPA)。tPA可有效溶解血腫,在ICH后血腫纖溶治療中療效受到多項(xiàng)臨床試驗(yàn)的認(rèn)可。然而,有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),tPA在輔助清除血腫的同時(shí),存在促進(jìn)水腫形成、增加炎癥反應(yīng)、促進(jìn)神經(jīng)毒性等副作用。這些報(bào)道使tPA在顱內(nèi)纖溶治療的應(yīng)用受到了質(zhì)疑。尿激酶(urokinase-type plasminogen activator,uPA),作為一個(gè)纖溶老藥(1999年后因停產(chǎn)退出美國市場(chǎng)),在我國廣泛應(yīng)用于ICH后血腫纖溶治療。在部分幕上腦出血,微創(chuàng)手術(shù)聯(lián)合血腫腔內(nèi)uPA注射治療已達(dá)成專家共識(shí),為A級(jí)推薦。然而,由于對(duì)于uPA和tPA這兩種纖溶藥物在ICH后血腫纖溶治療應(yīng)用上缺少臨床前或臨床研究,藥物的選擇仍憑借經(jīng)驗(yàn)。為了探索uPA與tPA在大鼠腦出血后血腫纖溶治療中的作用及機(jī)制,本研究采用大鼠自體血注射誘導(dǎo)腦出血模型,從兩部分進(jìn)行研究:第一部分觀察uPA和tPA在大鼠ICH后血腫纖溶治療的作用,包括纖溶療效及對(duì)PHE的影響;第二部分則通過檢測(cè)血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)相關(guān)指標(biāo),對(duì)藥物于BBB的效應(yīng)及機(jī)制進(jìn)行研究。一、尿激酶與阿替普酶在大鼠腦出血后血腫纖溶治療中的作用目的以大鼠ICH模型為基礎(chǔ),分別給予uPA和tPA血腫腔內(nèi)注射處理,3天后檢測(cè)血腫體積、PHE范圍、腦水含量(brain water content,BWC)、BBB通透性及動(dòng)物行為學(xué),觀察uPA和tPA在ICH后血腫纖溶治療的療效。方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組,即sham組、ICH組、ICH+saline組、ICH+tPA組和ICH+uPA組,每組14只。術(shù)后30分鐘,ICH+saline組、ICH+tPA組和ICH+uPA組分別于血腫中心給予2μl體積的saline、tPA(10μg/μl)、uPA(100 IU/μl),sham組為空白對(duì)照組,只進(jìn)針不注血,ICH組只注血不給藥。術(shù)后第三天,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)和前肢放置實(shí)驗(yàn)以做行為學(xué)評(píng)分,后行磁共振掃描以測(cè)算血腫體積及PHE范圍。掃描完成后,每組中8只測(cè)量BWC以評(píng)估水腫程度,剩余6只行伊文斯藍(lán)(evans blue,EB)滲出實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)BBB通透性。結(jié)果1.磁共振圖像分析發(fā)現(xiàn),uPA與tPA血腫腔內(nèi)注射均可有效縮小血腫體積和PHE范圍,且uPA減少PHE范圍的作用更加顯著(uPA vs tPA,p0.05)。此外,BWC的測(cè)量結(jié)果顯示,uPA可減輕患側(cè)半球水含量,而tPA組與對(duì)照組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)和前肢放置試驗(yàn)結(jié)果顯示uPA可顯著改善大鼠ICH后神經(jīng)功能,而tPA對(duì)于神經(jīng)功能改善未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。3.uPA與tPA均有效減小了EB染料血管外滲出,提示兩種纖溶藥物在穩(wěn)定ICH后BBB通透性上具有積極作用。結(jié)論大鼠ICH后血腫腔內(nèi)uPA或tPA注射均可縮小血腫體積及PHE范圍,對(duì)于減少出血后BBB損傷具有一定積極作用。二、尿激酶與阿替普酶對(duì)腦出血后血腦屏障的效應(yīng)及機(jī)制研究目的建立大鼠ICH模型,觀察給藥后,BBB相關(guān)緊密連接蛋白(claudin-5、ZO-1)及細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的表達(dá)情況,探討uPA與tPA對(duì)BBB的保護(hù)作用及機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分3組,即ICH+saline組、ICH+tPA組和ICH+uPA組,每組18只。分別于術(shù)后30分鐘于血腫中心給予2μl體積的saline、tPA(10μg/μl)、uPA(100IU/μl)。術(shù)后第三天,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(5/組)通過免疫熒光染色檢測(cè)BBB相關(guān)緊密蛋白(ZO-1,Claudin-5)的表達(dá),另外,ZO-1還采用蛋白質(zhì)印跡(western blot,WB)法(4/組)進(jìn)行定量比較;采用WB及實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)MMPs(4/組)的表達(dá);采用WB(5/組)檢測(cè)平p65與磷酸化p65(p-p65)水平,通過p-p65/p-65間接反映NF-κB通路活性。結(jié)果1.通過對(duì)血腫周圍ZO-1表達(dá)檢測(cè)(免疫熒光,WB)和血腫周圍及水腫區(qū)皮質(zhì)的claudin-5免疫染色,發(fā)現(xiàn)uPA與tPA均可上調(diào)這兩種BBB相關(guān)緊密連接蛋白表達(dá),提示兩種藥物對(duì)維持BBB完整性有積極作用。2.RT-PCR及WB結(jié)果顯示,給藥組有效降低了大鼠ICH后MMP-12表達(dá),此外,uPA還降低了MMP-2的表達(dá),而tPA對(duì)于MMP-2的影響并不顯著。對(duì)于MMP-9,給藥均上調(diào)了其表達(dá),而tPA的上調(diào)作用更加明顯。3.通過WB結(jié)果計(jì)算p-p65/p65比值,間接反映NF-κB通路激活程度,發(fā)現(xiàn)tPA治療使NF-κB通路激活明顯增加,而uPA對(duì)此無顯著影響。結(jié)論盡管大鼠ICH后血腫腔內(nèi)uPA和tPA注射對(duì)NF-κB通路激活作用不同導(dǎo)致MMPs表達(dá)存在差異,整體效應(yīng)上,兩種藥物均對(duì)維持BBB完整性具有一定保護(hù)作用。
[Abstract]:Intracerebral hemorrhage (ICH) has the highest mortality and disability rate, and is the most destructive type of stroke. According to a national survey published in 2017, the age-standardized incidence of stroke in China is 246.8/100,000 per year, of which 23.8% is ICH, much higher than in most Western countries. However, the injury mechanism of ICH is not yet complete. Clearly, physical compression of hematoma after ICH and formation of secondary perihematomal edema (PHE) can affect the prognosis of patients. Therefore, timely removal of hematoma to reduce primary and secondary injuries is particularly important in ICH treatment. However, craniotomy is not always suitable for patients limited by the site of hematoma and surgical trauma. Compared with traditional surgery, minimally invasive surgery combined with intracavitary injection of fibrinolytic drugs for hematoma has less trauma to normal brain tissue, better curative effect and wider application. In recent years, it has attracted more and more attention and gradually developed into a promising treatment for ICH. TPA can effectively dissolve hematoma. The efficacy of tPA in fibrinolytic therapy of hematoma after ICH has been approved by many clinical trials. However, animal experiments have found that tPA can promote edema formation, increase inflammation and promote neurotoxicity while assisting in the removal of hematoma. The application of intracranial fibrinolytic therapy has been questioned. Urokinase (uPA), as an old fibrinolytic drug, has been widely used in China as fibrinolytic therapy for post-ICH hematoma. However, due to the lack of preclinical or clinical studies on the use of uPA and tPA in fibrinolytic therapy of hematoma after ICH, the choice of drugs still depends on experience. In order to explore the role and mechanism of uPA and tPA in fibrinolytic therapy of hematoma after intracerebral hemorrhage in rats, we used autologous blood injection to induce cerebral hemorrhage model. The first part is to observe the effect of uPA and tPA on the fibrinolytic therapy of hematoma after ICH in rats, including the effect of fibrinolysis and the effect on PHE. The second part is to study the effect and mechanism of uPA and tPA on BBB by detecting the related indexes of blood-brain barrier (BBB). Objective To observe the therapeutic effect of uPA and tPA on hematoma after ICH by intracavitary injection of uPA and tPA. The hematoma volume, PHE range, brain water content (BWC), BBB permeability and animal behavior were measured after 3 days. The patients were divided into 5 groups: sham group, ICH group, ICH + saline group, ICH + tPA group and ICH + uPA group, with 14 rats in each group. 30 minutes after operation, ICH + saline group, ICH + tPA group and ICH + uPA group were given saline, tPA (10 UG / ml), uPA (100 IU / ml), sham group was blank control group, and ICH + tPA group was given only blood injection without administration. After the scan, 8 rats in each group were measured for BWC to evaluate the degree of edema, and the remaining 6 rats were performed Evans blue (EB) exudation test to detect the permeability of BBB. Results 1. Magnetic resonance imaging analysis showed that U. Both intracavitary injection of PA and tPA could effectively reduce the volume and PHE range of hematoma, and uPA could reduce the PHE range more significantly (uPA vs tPA, p0.05). In addition, BWC measurements showed that uPA could reduce the hemispheric water content of the affected side, while there was no significant difference between tPA group and control group. 2. Angle rotation test and forelimb placement test showed that uPA could significantly reduce the PHE range. Conclusion Both uPA and tPA can reduce the volume of hematoma and the range of PHE after ICH in rats. Objective To establish a rat ICH model and observe the expression of BBB-related tight junction protein (claudin-5, ZO-1) and matrix metalloproteinases (MMPs) after administration. Methods The experimental animals were randomly divided into three groups: ICH+saline group, ICH+tPA group and ICH+uPA group, 18 rats in each group. At 30 minutes after operation, saline, tPA (10 ug/ml) and uPA (100 IU/ml) of 2 UG volume were given to the hematoma center. On the third day after operation, BBB correlation was detected by immunofluorescence staining in the experimental animals (5/group). The expression of compact protein (ZO-1, Claudin-5) was compared quantitatively by Western blot (WB), real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), and the levels of pingp65 and phosphorylated p65 (p-p65) were detected by WB (5/group), respectively. Results 1. By detecting the expression of ZO-1 around hematoma (immunofluorescence, WB) and claudin-5 immunostaining around hematoma and edema area cortex, it was found that uPA and tPA could up-regulate the expression of these two BBB-related tight junction proteins, suggesting that the two drugs have a positive effect on maintaining the integrity of BBB. 2. RT-PCR and WB results were obvious. In addition, uPA also decreased the expression of MMP-2, but the effect of tPA on the expression of MMP-2 was not significant. For MMP-9, the administration of tPA increased the expression of MMP-2, and the up-regulation effect of tPA was more obvious. 3. The ratio of p-p65/p65 calculated by WB results indirectly reflected the activation of NF-kappa B pathway. It was found that tPA treatment made the activation of NF-kappa B pathway. Conclusion Although the activation of NF-kappa B pathway is different between uPA and tPA injection in ICH rats, the expression of MMPs is different. On the whole effect, both drugs have a certain protective effect on the integrity of BBB.
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743.34

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本文編號(hào)：2211662