本文關(guān)鍵詞：兩個單基因遺傳病家系致病基因的分子遺傳學(xué)研究

  更多相關(guān)文章： 單基因遺傳病 常染色體顯性多囊腎病 PKD1基因 遺傳性共濟(jì)失調(diào) SCA3基因 突變分析

【摘要】：遺傳病是由基因組中的一個或多個異常引起的遺傳問題,往往在出生時就被決定了(先天性),也可后天發(fā)病。如遺傳性痙攣性截癱、遺傳性進(jìn)行性假性類風(fēng)濕發(fā)育不良癥、多囊腎病等,完全由遺傳因素決定發(fā)病,但是要經(jīng)過幾年、十幾年甚至幾十年才能出現(xiàn)明顯的癥狀。大多數(shù)遺傳性疾病是相當(dāng)罕見的,發(fā)病率為幾千到幾百萬分之一。單基因遺傳病是指由單一一個基因突變導(dǎo)致的疾病�，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了有超過6500種的單基因遺傳病。單基因疾病可以通過幾種途徑傳遞給后代。常染色體顯性遺傳病位于常染色體上的兩個等位基因中,如有一個突變,這個突變基因的異常效應(yīng)就能顯示發(fā)病。這類疾病已達(dá)1700多種,如家族性多發(fā)性結(jié)腸息肉等。其遺傳系譜特點是;遺傳與性別無關(guān),男女發(fā)病機(jī)會均等；患者雙親往往有一方為患者；常見連續(xù)幾代的遺傳。顯性致病基因有時由于內(nèi)外環(huán)境的影響,雜合子個體攜帶顯性致病基因但并不表達(dá),即不完全外顯。常染色體顯性遺傳病的外顯率為60%-90%。常染色體隱性遺傳病致病基因為位于常染色體上的隱性基因,當(dāng)隱性基因純合時才能發(fā)病。即隱性遺傳病患者,大多是由兩個攜帶者所生的后代。已確定這類疾病約1200多種,如先天性聾啞、白化病、苯丙酮尿癥。常染色體隱性遺傳病的譜系特點：男女發(fā)病機(jī)會均等,發(fā)病與性別無關(guān)；常是越代遺傳；近親婚配時,子女中隱性遺傳病患病率大為增高。性染色體連鎖遺傳病(sex-linked disorder)包括X連鎖遺傳病和Y連鎖遺傳病。以X連鎖隱性遺傳病為多見,致病基因在X染色體上,性狀是隱性的,女性大多只是攜帶者；X連鎖顯性遺傳病病種較少,這類病女性發(fā)病率高,但病情較男性輕：Y連鎖遺傳病的特點是男性傳遞給兒子,女性不發(fā)病,Y連鎖遺傳病極少見。常染色體顯性多囊腎病(Autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)是一種常見的遺傳性腎病,以逐漸增多、增大的雙邊腎臟囊腫為主要特點,并最終能導(dǎo)致腎衰竭。它在全世界范圍的發(fā)病率大約在1/400至1/1000之間,并且占了晚期腎移植病人的5%-10%。腎臟外也會出現(xiàn)一些癥狀,主要是其它上皮器官如肝和胰腺的囊腫。此外,有些ADPKD病人有些還會表現(xiàn)出結(jié)締組織的缺陷,如顱內(nèi)動脈瘤。脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(spinocerehenar ataxia, SCAs)是一類包括多種亞型在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,具有高度的遺傳異質(zhì)性,往往在成年期發(fā)病。常見的損害部位包括了從主要的神經(jīng)系統(tǒng)(小腦、腦干、脊髓、周圍神經(jīng)等)到神經(jīng)系統(tǒng)之外的部位(眼、骨骼、心臟等),臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣。影像學(xué)檢查主要表現(xiàn)為小腦皮質(zhì)的逐漸萎縮。在本研究中,我們采集到了兩個常染色體顯性遺傳的單基因病家系,對上述兩種單基因遺傳病進(jìn)行了分子遺傳學(xué)研究,檢查了相關(guān)致病基因并鑒定了致病突變。所進(jìn)行的相關(guān)研究為上述疾病的病理生理學(xué)機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。同時也為家系中成員的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了保障。第一部分一個顯性多囊腎病家系的致病基因突變分析多囊腎病(Polycystic kidney disease, PKD)是一種嚴(yán)重影響生活甚至威脅生命的單基因遺傳病。它的主要臨床癥狀是腎臟出現(xiàn)許多充滿液體的囊腫。多囊腎病人表現(xiàn)出進(jìn)行性的囊腫形成和腫大、腎臟腫大,最終發(fā)展成晚期腎衰竭。此病主要分為常染色體顯性遺傳(ADPKD)和常染色體隱性遺傳(ARPKD)。常染色體顯性多囊腎病(Autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)是一種常見的遺傳性腎病,發(fā)病率在1/500到1/1000之間。以逐漸增多、增大的雙邊腎臟囊腫為主要特點,并最終能導(dǎo)致腎衰竭。腎外臨床表現(xiàn)包括其它上皮器官的囊腫,例如肝、脾,病人也表現(xiàn)出結(jié)締組織缺陷,例如顱內(nèi)動脈瘤、心瓣膜異常、夾層動脈瘤、腹壁疝,高血壓是ADPKD非常常見的癥狀。ADPKD患者的腎功能會逐漸喪失。ADPKD有兩個已鑒定的致病基因：PKD1 (16pl3.3)-編碼多囊蛋白1 (polycystin 1, PC1)和PKD2 (4q22)-編碼多囊蛋白2(polycystin 2, PC2)。 PKD1突變導(dǎo)致的多囊腎病占全部多囊腎病的85%,剩下的15%由PKD2基因上的致病突變導(dǎo)致,而且PKD1突變導(dǎo)致的多囊腎往往比PKD2突變導(dǎo)致的癥狀更為嚴(yán)重。此外,多囊腎的癥狀和嚴(yán)重程度在不同的患者甚至在同一個家系的不同患者之間往往都有很大的不同,這表明多囊腎的病程可能受其他基因或環(huán)境因素的影響。Alport綜合癥(Alport syndrome, AS)也是一種遺傳性腎病,發(fā)病率至少為1/50000。它常常在兒童期起病并表現(xiàn)為鏡下血尿,隨后隨著年齡的增長逐漸出現(xiàn)肉眼血尿、蛋白尿和腎功能不全,并最終在成年期形成腎功能衰竭。部分病人會有腎臟外的癥狀,主要包括逐漸的耳聾、視覺障礙。Alport綜合癥主要由X連鎖的COL4A5基因突變導(dǎo)致(占85%),為顯性致��；剩下的15%由常染色體隱性突變導(dǎo)致。我們在南方醫(yī)院發(fā)現(xiàn)了一個含有3代人的多囊腎病家系,家系共有5名已知患病成員,初步考慮此家系為常染色體顯性多囊腎病。我們對該家系做了臨床分析和相關(guān)的檢查,采集了家系成員的DNA樣本,并得到了先證者的腎組織樣本。通過對先證者的全基因組二代測序我們得到了其可能致病的PKD1致病突變,此突變?yōu)橐拼a突變并與家系中的患者出現(xiàn)了共分離。同時在家系中發(fā)現(xiàn)了一個被注釋為致病的COL4A5突變G953V——rs78972735,此基因突變會導(dǎo)致更為嚴(yán)重的alport綜合癥。通過對比PKD1基因編碼的蛋白PC1在先證者組織和正常組織中的差異,發(fā)現(xiàn)病人的晚期衰竭腎臟中的PC1的表達(dá)提高了約1.7倍；組織免疫化學(xué)也提示在患者膨大的小管上皮有明顯的表達(dá)提高。同時pS6/S6比例的提高和Ki67陽性細(xì)胞增多提示了患者小管上皮處于高增值的狀態(tài)；但TUNEL實驗顯示患者的腎臟的凋亡細(xì)胞也明顯增多了——這表明患者的腎臟組織處于一種同時高增殖高凋亡的重構(gòu)過程。一些機(jī)制重構(gòu)相關(guān)基因的表達(dá)量的顯著提高也反與晚期腎臟出現(xiàn)的纖維化情況吻合。通過分析家系中COL4A5突變攜帶者的臨床表現(xiàn),我們發(fā)現(xiàn)此COL4A5突變在家系中并沒有導(dǎo)致alport綜合癥,同時生物信息學(xué)預(yù)測也有矛盾的地方；分析報道此突變的文獻(xiàn)我們發(fā)現(xiàn)只有一例此COL4A5單獨突變致病的患者,患者病情比通常點突變患者的情況嚴(yán)重很多并且在調(diào)查中沒有檢測此基因的重排。所以,我們認(rèn)為單獨的COL4A5 G953V突變可能是不致病的。該家系新的PKD1致病突變的發(fā)現(xiàn),為該家系今后的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷服務(wù)提供了便利。第二部分一個脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)家系的致病基因突變分析脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(spinocerehenar ataxia, SCAs),是一類包括多種亞型在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。常見的損害部位包括了從主要的神經(jīng)系統(tǒng)(小腦、腦干、脊髓、周圍神經(jīng)等)到神經(jīng)系統(tǒng)之外的部位(眼、骨骼、心臟等),臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣。其主要的臨床特征為：初期隱襲起病,走路時步履不穩(wěn),肢體搖晃,動作反應(yīng)遲緩及準(zhǔn)確性變差;中期逐漸發(fā)展為說話時發(fā)音含糊不清,無法控制音調(diào),眼球轉(zhuǎn)動不平順,影像容易產(chǎn)生重疊,肌肉不協(xié)調(diào)感加重,無法寫字,有時感到吞咽困難；晚期時說話極不清楚,甚至無法語言,肢體乏力,不能站立,需靠輪椅代步,理解能力逐步下降,最后失去意識,昏睡不醒。影像學(xué)檢查主要表現(xiàn)為小腦皮質(zhì)的逐漸萎縮。SCAs臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣,基因分型是唯一確切有效的分類方法。按遺傳方式,SCAs可以分為常染色體顯性、常染色體隱性和X連鎖隱性三類。其中以常染色體顯性最為常見,到目前為止,已經(jīng)有大約35個位點被定位出來,并被分類為3個大的類型：(1)編碼區(qū)CAG三核苷酸重復(fù)增多導(dǎo)致的多聚谷氨酰胺性共濟(jì)失調(diào),主要包括SCA3、SCA6和SCA7；(2)非編碼區(qū)重復(fù)序列增多導(dǎo)致的共濟(jì)失調(diào)；(3)傳統(tǒng)突變(移碼、錯義突變、無義突變、剪切突變等)和拷貝數(shù)變異導(dǎo)致的共濟(jì)失調(diào)。常染色體隱性遺傳相對少見,主要是Freidreich病,在西方人中相對多見,國內(nèi)罕見。但是即使發(fā)現(xiàn)了如此多的致病基因,仍然有40%左右的SCAs患者找不到致病原因,說明仍然存在未發(fā)現(xiàn)的致病基因,而且?guī)缀趺磕甓加行碌闹虏』虮话l(fā)現(xiàn)。我們在珠江醫(yī)院發(fā)現(xiàn)了一個脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)家系,家系中共有4名已知患者并呈現(xiàn)明顯的顯性遺傳。家系中的患者具有典型的脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)癥狀,發(fā)病年齡在40歲左右。先證者最初出現(xiàn)不明原因的步行不穩(wěn),走路及站立時,身體向雙邊倒,步行緩慢,起立困難,隨后癥狀進(jìn)行性加重。雙下肢淺感覺減退,雙上肢橈骨膜、肱二、三頭肌反射減弱。雙下肢膝、跟腱反射消失。MRI顯示：雙側(cè)小腦萎縮,腰3/4及腰4/5椎間盤終板周圍炎。在研究病人的癥狀和中國SCAs流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果后,我們決定優(yōu)先篩查家系SCA3、SCA1、 SCA3、SCA6、SCA7的基因突變。在隨后的電泳和毛細(xì)管電泳中我們發(fā)現(xiàn)家系中患者的SCA3基因CAG拷貝數(shù)超出了正常閾值——分別為Ⅲ1：27/68次;Ⅲ3：27/68次,而年齡相符的家系正常人沒有超過。同時在家系中發(fā)現(xiàn)了3名未到發(fā)病年齡的潛在患者,分別為：Ⅲ4：14/68次;Ⅳ8：14/68次;Ⅳ10：29/71次。我們的發(fā)現(xiàn)為家系成員之后的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：單基因遺傳病 常染色體顯性多囊腎病 PKD1基因 遺傳性共濟(jì)失調(diào) SCA3基因 突變分析
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R596.2
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 第一部分 一個顯性多囊腎病家系的致病突變分析16-44
• 第一章 前言16-18
• 第二章 實驗材料18-22
• 2.1 研究對象18
• 2.2 全體家系成員的外周血樣本18
• 2.3 先證者的腎組織樣本和正常的腎組織樣本18
• 2.4 主要的試劑18-21
• 2.4.1 基因組DNA與組織RNA提取試劑18-19
• 2.4.2 PCR試劑和核酸電泳試劑19-20
• 2.4.3 總蛋白提取試劑20
• 2.4.4 逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑20
• 2.4.5 免疫組化和免疫熒光試劑20-21
• 2.5 主要的儀器設(shè)備21-22
• 第三章 實驗方法22-33
• 3.1 臨床癥狀檢查和家系圖22
• 3.2 家系樣本的采集22
• 3.3 外周血基因組DNA的提取22-23
• 3.4 腎組織總RNA和總蛋白的提取23-24
• 3.4.1 腎組織總RNA的提取23-24
• 3.4.2 腎組織蛋白的提取24
• 3.5 基因組DNA、RNA和蛋白濃度測定24-25
• 3.5.1 DNA濃度的測定24
• 3.5.2 RNA濃度的測定24
• 3.5.3 蛋白濃度的測定(BCA法)24-25
• 3.6 全基因組二代測序和直接測序25
• 3.7 相關(guān)基因MRNA定量分析25-27
• 3.7.1 總RNA逆轉(zhuǎn)錄25-26
• 3.7.2 熒光定量PCR26-27
• 3.8 免疫組織化學(xué)、免疫熒光和TUNEL27-29
• 3.8.1 石蠟包埋切片27
• 3.8.2 免疫組織化學(xué)27-28
• 3.8.3 免疫熒光28
• 3.8.4 TUNEL28-29
• 3.9 SDS-PAGE電泳和WESTERN BLOT29-32
• 3.9.1 SDS-PAGE電泳29-30
• 3.9.2 WESTERN BLOT30-32
• 3.10 突變致病性預(yù)測32
• 3.11 數(shù)據(jù)庫32-33
• 第四章 實驗結(jié)果33-42
• 4.1 家系圖及家系成員的臨床特征33-36
• 4.2 突變檢測36-37
• 4.3 組織PC1表達(dá)分析37-38
• 4.4 增殖和凋亡分析38-39
• 4.5 基質(zhì)重構(gòu)相關(guān)基因的表達(dá)分析39-40
• 4.6 突變的致病性評估40-42
• 第五章 分析與討論42-44
• 第二部分 一個脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)家系的致病基因突變鑒定44-67
• 第一章 前言44-45
• 第二章 實驗材料45-48
• 2.1 研究對象45
• 2.2 全體家系成員外周血樣本45
• 2.3 主要的試劑和耗材45-46
• 2.3.1 基因組DNA提取試劑45
• 2.3.2 常規(guī)PCR和電泳試劑45-46
• 2.3.3 毛細(xì)管電泳試劑46
• 2.4 主要儀器設(shè)備46-48
• 第三章 實驗方法48-54
• 3.1 臨床癥狀檢查和家系圖48
• 3.2 家系外周血樣本采集48
• 3.3 樣本基因組DNA的提取48-49
• 3.4 診斷技術(shù)流程49
• 3.5 候選基因篩查49-51
• 3.6 引物設(shè)計51-52
• 3.7 PCR擴(kuò)增體系52
• 3.8 瓊脂糖凝膠電泳52-53
• 3.9 毛細(xì)管電泳53-54
• 第四章 實驗結(jié)果54-66
• 4.1 家系中已知的病患情況54
• 4.2 先證者的臨床特征54-55
• 4.3 突變檢測結(jié)果55-66
• 第五章 分析與討論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-70
• 攻讀學(xué)位期間成果70-71
• 英文縮略詞表71-73
• 致謝73-74

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 耿鈺;;單基因遺傳病的防控與治療[J];華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2010年03期

2 陶玉貞;單基因遺傳病1例[J];黑龍江醫(yī)學(xué);1996年05期

3 劉永寧;;單基因遺傳病的防控與治療分析[J];中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用;2014年04期

4 霍建華;單基因遺傳病類型判定[J];中學(xué)生物教學(xué);2004年12期

5 涂冰,柳小年;單基因遺傳病發(fā)病風(fēng)險的臨床估計與教學(xué)[J];衛(wèi)生職業(yè)教育;2002年12期

6 鐘昌高;單基因遺傳病的植入前遺傳學(xué)診斷研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊;2002年01期

7 刁國慶;單基因遺傳病的系譜分析[J];社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志;2005年05期

8 徐莉娟;;單基因遺傳病及其防治[J];中國民族民間醫(yī)藥;2009年17期

9 王宏梅;;臨床實踐中影響單基因遺傳病分析的因素[J];北方藥學(xué);2012年01期

10 孫志國;;系譜分析在單基因遺傳病分類中的作用[J];中國醫(yī)藥指南;2012年28期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 賀林;;對單基因遺傳病和多基因遺傳病研究的粗淺認(rèn)識[A];中國的遺傳學(xué)研究——中國遺傳學(xué)會第七次代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編[C];2003年

2 張尼娜;高雅;張磊;朱倩;魏曉明;劉剛;王坤;;目標(biāo)序列捕獲高通量測序在單基因遺傳病診斷中應(yīng)用[A];第十二次全國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2014年

3 曹文靜;高雅;黃輝;吳靜;陳演華;王威;;全外顯子組測序在單基因遺傳病診斷中應(yīng)用[A];第十二次全國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2014年

4 Dan—ning Hu;;Award Lecture獲獎演說：眼科遺傳學(xué)進(jìn)展及對策[A];中華醫(yī)學(xué)會第十二屆全國眼科學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2007年

5 馬用信;;人類致病基因定位和克隆[A];中國優(yōu)生科學(xué)協(xié)會2004年優(yōu)生科學(xué)學(xué)術(shù)交流大會論文集[C];2004年

6 丁宇;余永國;楊培榕;黃曉東;沈永年;應(yīng)大明;姚如恩;傅啟華;;MLPA技術(shù)在單基因遺傳病SMA、CAH和Digeoge綜合征基因診斷中的應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會第十七次全國兒科學(xué)術(shù)大會論文匯編（下冊）[C];2012年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 仰東萍 記者 李穎;成功避免單基因遺傳病試管嬰兒誕生[N];科技日報;2014年

2 許沈華;500多種單基因遺傳病可確診[N];家庭醫(yī)生報;2007年

3 本報記者 白毅;罕見病防治，重視老藥作用[N];中國醫(yī)藥報;2014年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 王劍;單基因遺傳病新致病基因的鑒定及其致病機(jī)制探索[D];上海交通大學(xué);2014年

2 鐘昌高;單基因遺傳病的基因診斷及其應(yīng)用研究[D];中南大學(xué);2003年

3 石立松;單基因遺傳病的致病基因定位及候選基因分析[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 熊君;兩個單基因遺傳病家系致病基因的分子遺傳學(xué)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

2 王云;單基因遺傳病的突變篩查與體外表達(dá)系統(tǒng)鑒定[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

，

本文編號：981479