發(fā)布時(shí)間：2017-09-25 02:27

  本文關(guān)鍵詞：利拉魯肽對(duì)糖尿病合并非酒精脂肪性肝病大鼠自噬與肝細(xì)胞脂肪變性作用機(jī)制的研究

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【摘要】：目的:通過觀察利拉魯肽(Liraglutide)干預(yù)治療糖尿病(DM)合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)C3ⅡmRNA及蛋白表達(dá)的變化,并光鏡下觀察肝細(xì)胞脂肪變性的變化,同時(shí)加用氯喹阻斷自噬體與溶酶體融合抑制自噬后比較上述指標(biāo)變化,探討自噬與肝臟脂質(zhì)沉積的關(guān)系及利拉魯肽通過調(diào)節(jié)自噬對(duì)肝細(xì)胞脂肪變性的影響。方法:1.DM合并NAFLD大鼠模型制備:44只4~5周齡,體重在l80g~200gWistar雄性大鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)l周,每籠6只。后將大鼠隨機(jī)分為A、B兩組,A組10只,喂以普通飼料13.4kJ/g,其中脂肪提供熱量占10.2%,蛋白質(zhì)占23.3%,碳水化合物占66.5%;B組34只,喂以高糖高脂飼料21.8kJ/g,其中脂肪提供熱量占56.0%,蛋白質(zhì)占7.0%,碳水化合物占37.0%。兩組大鼠均自由飲水,每日早晚各投食一次,室溫控制在18~22℃,相對(duì)濕度30%~70%。12周時(shí)剪尾采血,用快速血糖儀測兩組大鼠空腹血糖(FBG),A組大鼠FBG 4.4-4.9mmol/L,B組大鼠FBG 5.3-5.9mmol/L。并予B組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)25mg/kg,A組大鼠注射以等體積的生理鹽水,72h后剪尾采血快速血糖儀測FBG≥7.8mmol/L視為糖尿病造模成功,其中A組大鼠血糖均在正常范圍,B組大鼠死亡1只,其余均成模。從B組大鼠中隨機(jī)取8只大鼠處死,取肝組織行HE染色,光鏡下觀察肝小葉內(nèi)㧐30%的肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變,并以大泡性脂肪變?yōu)橹髡叽_定為NAFLD造模成功,8只大鼠均成模。2.實(shí)驗(yàn)分組及檢測指標(biāo):將A組大鼠設(shè)為正常糖耐量對(duì)照組(NGT組,n=10),將B組大鼠設(shè)為實(shí)驗(yàn)組,并隨機(jī)分為三組:DM合并NAFLD組(DM/NAFLD組,n=9);利拉魯肽干預(yù)組(LIR組,n=8),予皮下注射利拉魯肽,100ug/Kg,Bid;利拉魯肽+自噬抑制劑氯喹(Chloroquine,CQ)組(LIR+CQ組,n=8),予皮下注射射利拉魯肽,100ug/kg,bid及氯喹,50mg/kg,每三天一次,共干預(yù)4周。后以20%烏拉坦腹腔注射麻醉,開腹,取腹主動(dòng)脈血,離心,分離血清后放于4℃冰箱保存,待生化方法檢測甘油三酯(tg)、總膽固醇(tc)、高密度脂蛋白膽固醇(hdl)、低密度脂蛋白膽固醇(ldl)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ast),以反應(yīng)各組大鼠糖脂代謝及肝功能情況。取肝臟組織稱取肝濕重,計(jì)算肝指數(shù),反應(yīng)各組大鼠肝臟脂質(zhì)沉積情況;取內(nèi)臟脂肪,計(jì)算內(nèi)臟脂肪相對(duì)含量(vf/w),反應(yīng)大鼠腹部脂肪含量;另切取肝組織100mg錫箔紙包好放于凍存管,后投入液氮保存,待pcr法檢測自噬相關(guān)標(biāo)志物lc3Ⅱmrna,反應(yīng)肝細(xì)胞自噬變化。在肝右葉距邊緣5mm處取1cm×1cm×0.5cm肝組織塊浸泡于10%甲醛溶液固定48小時(shí)后進(jìn)行石蠟包埋,備做病理切片,用于免疫組化法檢測自噬相關(guān)標(biāo)志物lc3Ⅱ蛋白及光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞脂肪變性。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:上述指標(biāo)均為計(jì)量資料,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(`x±s)表示,運(yùn)用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,4組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布及方差齊性,4組間兩兩比較素采用單因素方差分析(anova),lsd檢驗(yàn),p≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.各組大鼠一般狀況:適應(yīng)性喂養(yǎng)期間,每只大鼠飲食量、體重?zé)o明顯差異,精神狀態(tài)良好,毛色光澤。開始造模期間,b組(高糖高脂喂養(yǎng))大鼠較a組(普通飼料喂養(yǎng))大鼠飲食量、體重均增加,b組大鼠體型肥胖、少動(dòng)。造模成功后,藥物干預(yù)期間,ngt組大鼠飲食量較之前無變化,體重呈穩(wěn)定增長,精神狀態(tài)良好,毛色光澤;dm/nafld組大鼠較同期ngt組大鼠體重增加,少動(dòng);lir組大鼠較同期dm/nafld組大鼠飲食量、體重均下降,精神狀態(tài)良好;lir+cq組大鼠精神萎靡,體毛蓬松失去光澤,有脫毛現(xiàn)象,與同期dm/nafld組大鼠比較,飲食量、體重均下降,與同期lir組大鼠比較,飲食量、體重?zé)o差別。2.光鏡下各組大鼠肝臟脂質(zhì)沉積變化及相關(guān)指標(biāo)比較:光境下ngt組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰,肝小葉結(jié)構(gòu)正常,胞漿可見極少量小脂滴。dm/nafld組大鼠肝細(xì)胞腫大,由多角形變成圓球形,胞質(zhì)透亮,呈氣球樣變,胞漿內(nèi)可見大量大小不一的脂滴,胞核被推向一邊。lir組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞內(nèi)僅見少量小脂滴。lir+cq組大鼠肝小葉正常結(jié)構(gòu)消失,肝細(xì)胞明顯增大,胞漿內(nèi)布滿脂滴。與NGT組比較,DM/NAFLD組及LIR+CQ組大鼠肝濕重、肝指數(shù)、VF/W、脂肪變性肝細(xì)胞數(shù)/總肝細(xì)胞升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),LIR組大鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與DM/NAFLD組比較,LIR組大鼠肝濕重、肝指數(shù)、VF/W、脂肪變性肝細(xì)胞數(shù)/總肝細(xì)胞下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),LIR+CQ組肝濕重、肝指數(shù)、脂肪變性肝細(xì)胞數(shù)/總肝細(xì)胞升高,差異有統(tǒng)計(jì)計(jì)學(xué)意義(P0.05),VF/W差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。LIR+CQ組較LIR組大鼠肝濕重、肝指數(shù)、VF/W、脂肪變性肝細(xì)胞數(shù)/總肝細(xì)胞升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.各組大鼠肝細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)志物比較:與NGT組比較,DM/NAFLD組及LIR組大鼠LC3ⅡmRNA及蛋白表達(dá)增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),LIR+CQ組大鼠LC3ⅡmRNA及蛋白表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與DM/NAFLD組比較,LIR組大鼠LC3ⅡmRNA及蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),LIR+CQ組大鼠LC3ⅡmRNA及蛋白表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。LIR+CQ組較LIR組大鼠,LC3ⅡmRNA及蛋白表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.各組大鼠生化指標(biāo)比較:與NGT組比較,DM/NAFLD組及LIR+CQ組大鼠FBG、TG、TC、LDL、ALT、AST升高,HDL下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),LIR組大鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與DM/NAFLD組比較,LIR組大鼠TG、TC、LDL、ALT、AST下降,HDL升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),LIR+CQ組大鼠FBG下降,TG、TC、LDL、ALT升高,HDL下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),AST差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。LIR+CQ組較LIR組大鼠FBG、TG、TC、LDL、ALT、AST升高,HDL下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.在DM合并NAFLD早期階段已存在自噬增強(qiáng),用利拉魯肽干預(yù)后自噬進(jìn)一步增強(qiáng)。2.利拉魯肽能通過增強(qiáng)自噬減少DM合并NAFLD大鼠肝細(xì)胞脂肪變性,改善糖脂代謝紊亂及肝功能。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病 非酒精性 脂肪性肝病 利拉魯肽 自噬
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.1;R575.5
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-14
• 1 材料與方法14-20
• 1.1 主要試劑及儀器14
• 1.2 研究方法14-19
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理19-20
• 2 結(jié)果20-27
• 2.1 各組大鼠一般狀況20
• 2.2 光鏡下各組大鼠肝臟脂質(zhì)沉積變化及相關(guān)指標(biāo)比較20-23
• 2.3 各組大鼠肝細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)志物比較23-25
• 2.4 各組大鼠生化指標(biāo)比較25-27
• 3 討論27-31
• 4 結(jié)論31-32
• 參考文獻(xiàn)32-35
• 綜述35-43
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 致謝43-44
• 在學(xué)期間研究成果44-45
• 個(gè)人簡歷45

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本文編號(hào)：914844