本文關(guān)鍵詞：RIG-I抑制胰島β細胞增殖機制研究

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【摘要】：目的：R1G-Ⅰ (retinoic acid inducible gene-I)是一個典型的胞內(nèi)模式識別受體,能識別胞內(nèi)病毒雙鏈RNA,激活并參與多種炎癥因子表達的調(diào)節(jié)。最近有研究表明：1型糖尿病中,RIG-Ⅰ能激活,且參與胰島p細胞功能下調(diào)及糖尿病的發(fā)生。而RIG-Ⅰ是否參與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展并不清楚。本研究旨在探討RIG-Ⅰ對胰島p細胞增殖的調(diào)控機制極其對β細胞功能失代償?shù)挠绊憽７椒ǎ翰捎锰侵拘?0.4 mM棕櫚酸+16.7 mM葡萄糖)、炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF-α)及脂多糖(LPS)刺激胰島Min6細胞,并提取糖尿病db/db小鼠的胰島,建立胰島β細胞體外和體內(nèi)2型糖尿病模型。免疫印跡(Western blot)技術(shù)分別檢測激活的原癌基因Src (sarcoma gene)及RIG-Ⅰ的蛋白水平變化；免疫熒光觀察磷酸化Src (Y416)及RIG-Ⅰ的含量變化；EdU熒光標(biāo)記、流式細胞術(shù)分別評價細胞增殖及細胞周期進程的變化。給予RIG-Ⅰ特異性激活劑維甲酸(retinoic acid, RA)激活RIG-Ⅰ, Real-time RT-PCR和Western blot測定RIG-Ⅰ的]mRNA水平及蛋白水平；噻唑藍(MTT)法檢測胰島p細胞的生長活力,EdU熒光標(biāo)記分析胰島p細胞增殖情況,并用流式細胞術(shù)評價胰島β細胞的周期進程變化。采用胰島素樣生長因子-Ⅰ (Insulin like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)和維甲酸聯(lián)合處理Min6細胞,實時定量RT-PCR和免疫印跡分別檢測Src基因下游信號分子Skp2、STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3, STAT3)及細胞周期蛋白cyclin D1、E、CDK2、P27和p21的mRNA和蛋白水平；免疫熒光觀察磷酸化STAT3亞細胞定位；熒光素酶報告基因?qū)嶒?Luciferase Assay)分析STAT3的轉(zhuǎn)錄活性；免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)檢測p-Src分別與RIG-Ⅰ、STAT3的蛋白結(jié)合變化。結(jié)果：糖脂毒性(glucolipotoxicity)、炎癥因子(TNF-α)及脂多糖(LPS)能顯著上調(diào)胰島β細胞磷酸化Src及RIG-Ⅰ的蛋白水平；上調(diào)的RIG-Ⅰ導(dǎo)致胰島p細胞的增殖能力和生長活力都明顯下降,細胞凋亡增加,且細胞周期阻滯于G1期；胰島素樣生長因子-I處理Min6細胞后,RIG-Ⅰ的激活對cyclin D1、E、 CDK2、P27和p21的mRNA水平均無顯著影響,但誘導(dǎo)P27蛋白含量顯著上調(diào)；RIG-Ⅰ激活也抑制了Src基因下游信號分子Skp2的表達、減弱了磷酸化STAT3的轉(zhuǎn)錄活性且阻礙了Src與STAT3的蛋白相互結(jié)合。結(jié)論：糖脂毒性、炎癥因子(TNF-α)及脂多糖(LPS)能顯著激活胰島p細胞的Src活性。RIG-Ⅰ的上調(diào)能競爭性結(jié)合激活Src,從而阻礙p-Src與STAT3的蛋白結(jié)合,下調(diào)Skp2的蛋白水平和上調(diào)周期蛋白P27的表達,最終誘導(dǎo)胰島β細胞G1期阻滯,抑制其增殖。本論文研究揭示了RIG-Ⅰ的激活能夠阻斷Src/STAT3通路,通過影響Skp2/P27信號誘導(dǎo)細胞周期阻滯于G1期,使β細胞增殖受到抑制,最終在機體中導(dǎo)致胰島β細胞的整體功能失代償。這可能是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要誘因,該研究能為2型糖尿病的防治探尋新的藥物靶點和途徑。
【關(guān)鍵詞】：胰島β細胞 RIG-I Src 細胞周期 分子機制
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.1
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 前言10-14
• 材料和方法14-31
• 1. 實驗試劑與材料14-17
• 1.1 實驗動物14
• 1.2 細胞系14
• 1.3 質(zhì)粒14
• 1.4 儀器設(shè)備14-15
• 1.5 實驗試劑15-17
• 2. 研究方法17-31
• 2.1 細胞培養(yǎng)17
• 2.2 維甲酸(retinoic acid)及其他相關(guān)藥物配制17
• 2.3 總RNA的提取17-18
• 2.4 Real-time RT-PCR18-20
• 2.5 蛋白質(zhì)提取及其濃度測定20-21
• 2.6 小鼠原代胰島細胞的分離和培養(yǎng)21-23
• 2.7 免疫印跡(Western Blot)23-25
• 2.8 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)25-26
• 2.9 MTT法26-27
• 2.10 免疫熒光檢測27
• 2.11 EdU熒光標(biāo)記細胞增殖實驗27-28
• 2.12 細胞轉(zhuǎn)染28-29
• 2.13 流式細胞術(shù)檢測29
• 2.14 熒光素酶報告基因?qū)嶒?Luciferase Assay)29-30
• 2.15 數(shù)據(jù)處理30-31
• 結(jié)果31-38
• 1. 2型糖尿病模型中酪氨酸激酶Src被激活31
• 2. 小鼠2型糖尿病模型中β細胞增殖受到抑制31-32
• 3. RIG-I在2型糖尿病模型中功能增強32
• 4. RIG-I上調(diào)抑制胰島β細胞增殖32-33
• 5. RIG-I激活導(dǎo)致胰島β細胞周期相關(guān)蛋白P27積累33-34
• 6. RIG-I誘導(dǎo)Skp2依賴P27蛋白水平增加34-35
• 7. STAT3上調(diào)胰島β細胞Skp2的表達35
• 8. RIG-I功能上調(diào)抑制STAT3的轉(zhuǎn)錄活性35-36
• 9. RIG-I能阻斷Src與STAT3的結(jié)合36-38
• 實驗數(shù)據(jù)及英文注釋38-61
• 討論61-64
• 小結(jié)64-65
• 參考文獻65-71
• 附錄(一) 綜述71-88
• 參考文獻81-88
• 附錄(二) 縮略詞表88-89
• 附錄(三) 發(fā)表文章89-90
• 附錄(四) 致謝90

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