本文關(guān)鍵詞：Tim-3在糖尿病腎病中的表達(dá)

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【摘要】：[研究背景及目的]糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的常見(jiàn)重要并發(fā)癥。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)2015年的最新數(shù)據(jù)顯示,全球糖尿病患病率為8.8%,中國(guó)患病人數(shù)居全球首位。30%-40%的糖尿病患者患有腎病。盡管近年來(lái)糖尿病腎病的診斷和治療研究取得很大進(jìn)展,但是DN的致殘率和死亡率依然居高不下,因而深入研究DN的發(fā)生機(jī)制,尋求治療DN的新靶點(diǎn)顯得尤為重要。DN患者存在著長(zhǎng)期的免疫系統(tǒng)激活和微炎癥狀態(tài)。多種炎癥因子和免疫細(xì)胞參與DN的免疫損傷,炎癥因子TNF-α、N IL-1、IL-6和IL-18在糖尿病腎病動(dòng)物模型中明顯升高,升高的TNF-α、IL-6 和 IL-18與腎臟指數(shù)及尿蛋白排泄率增加明顯相關(guān),并且增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性、介導(dǎo)腎小球肥大、基底膜的增厚,引起內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)即使DN早期,在腎小球和腎間質(zhì)就有多種免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等)的浸潤(rùn),其中最主要的是巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞在腎臟的聚集會(huì)導(dǎo)致腎功能的下降,同時(shí)巨噬細(xì)胞分泌的炎性產(chǎn)物能誘導(dǎo)和加重炎癥的發(fā)生。巨噬細(xì)胞具有極強(qiáng)的異質(zhì)性,在不同環(huán)境刺激下分化為不同表型,發(fā)揮不同功能。眾所周知,巨噬細(xì)胞主要有兩種類(lèi)型：經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞(M1)和替代活化型巨噬細(xì)胞(M2)。M1主要分泌IL-12及iNOS等促炎因子,在Thl型免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。M2高表達(dá)IL-10、CD206、IL-6及Arg-1等分子,表現(xiàn)為抗炎活性,可減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中的巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。在一定條件下,M1和M2亞型可相互轉(zhuǎn)換。因此如果能找到促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2轉(zhuǎn)化的分子,就有可能找到對(duì)DN進(jìn)行免疫基礎(chǔ)治療的新的作用靶點(diǎn)。Tim-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containingmolecule-3)是2002年發(fā)現(xiàn)的新型免疫調(diào)節(jié)分子,最初被認(rèn)為特異性表達(dá)于活化的Thl細(xì)胞上,隨后的研究發(fā)現(xiàn)Tim-3廣泛表達(dá)于多種固有免疫細(xì)胞,如NK、DC、巨噬細(xì)胞等。研究證實(shí),Tim-3負(fù)向調(diào)控Th1細(xì)胞功能,并誘導(dǎo)Thl細(xì)胞凋亡介導(dǎo)免疫耐受的形成,參與多種自身免疫疾病發(fā)生。以上研究充分顯示了Tim-3在免疫負(fù)調(diào)控和免疫耐受誘導(dǎo)中的重要作用及其在免疫性疾病治療中的潛在價(jià)值。2015年Gut報(bào)道,肝細(xì)胞肝癌腫瘤微環(huán)境中TGF-β在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)巨噬細(xì)胞Tim-3表達(dá),并且促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2極化,激活NF-kB通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-6,從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng),提示Tim-3在組織微環(huán)境中調(diào)控巨噬細(xì)胞參與疾病發(fā)生。有報(bào)道,在1型糖尿病中,應(yīng)用Tim-3阻斷性抗體(RMT23)阻斷Gal-9-Tim3途徑可以抑制DC的活化,從而抑制Thl免疫反應(yīng),提示Tim-3可能參與糖尿病的發(fā)病。那么,Tim-3在糖尿病腎病中的表達(dá)及作用機(jī)制如何,迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以DN患者和動(dòng)物模型為研究對(duì)象,探討Tim-3在DN中的表達(dá)。[方法與結(jié)果]1.DN患者腎組織Tim-3表達(dá)明顯升高免疫組化檢測(cè)DN患者腎組織中Tim-3的表達(dá),結(jié)果顯示DN組Tim-3表達(dá)明顯升高；免疫組化雙染檢測(cè)糖尿病腎病腎穿組織中CD68及Tim-3的表達(dá),結(jié)果顯示CD68與Tim3顯著共定位,且DN腎組織中Tim-3+CD68+細(xì)胞數(shù)顯著高于HD組。2.DN患者外周血單核細(xì)胞上Tim-3較健康人明顯升高從山東大學(xué)齊魯醫(yī)院收集18例DN患者和16例健康人新鮮外周血,提取單個(gè)核細(xì)胞,檢測(cè)CD14+單核細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)。結(jié)果顯示：DN患者外周血 CD14+單核細(xì)胞Tim-3表達(dá)較健康人明顯升高(P＜0.05),且M1型單核細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)顯著升高(P0.05),提示單核細(xì)胞Tim-3可能通過(guò)調(diào)控單核巨噬細(xì)胞參與DN免疫損傷。3.DN小鼠腎臟和腹腔巨噬細(xì)胞Tim-3表達(dá)升高在摘除小鼠一側(cè)腎臟的前提下,應(yīng)用鏈脲佐菌素STZ(50mg/kg,溶于PH=4.45檸檬酸緩沖液)腹腔注射,連續(xù)5天,成功建立小鼠模型,檢測(cè)小鼠血肌酐、尿白蛋白肌酐比值、腎組織病理改變(PAS染色)。并用Type I膠原蛋白酶提取小鼠腎臟單個(gè)核細(xì)胞,流式檢測(cè)F4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞Tim-3的表達(dá)。結(jié)果顯示：模型鼠血糖、尿白蛋白肌酐比值明顯升高,腎組織PAS染色可見(jiàn)模型鼠腎小球系膜基質(zhì)明顯增多；腎臟F4/80+CD11 b+巨噬細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)明顯升高；(P0.05)。腹腔巨噬細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05)。我們應(yīng)用WesternBlot方法檢測(cè)腎臟Tim-3的表達(dá),同樣發(fā)現(xiàn)DN小鼠腎組織Tim-3表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05),進(jìn)一步提示Tim-3可能通過(guò)調(diào)控單核巨噬細(xì)胞參與DN免疫損傷。4.DN小鼠Treg細(xì)胞比例下降,Th17細(xì)胞比例升高應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析DN小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞中Treg和Th17細(xì)胞的比例Treg比例有下降趨勢(shì),Th17細(xì)胞比例明顯升高(P0.05)；同時(shí)應(yīng)用CBA技術(shù)檢測(cè)小鼠血清多種炎癥因子的分泌,發(fā)現(xiàn)IL-6有升高趨勢(shì)。5.DN小鼠腎組織IL-1β、TNF-α和IL-6表達(dá)明顯升高用Trizol法提取腎組織RNA,采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠腎臟IL-1β、TNF-α、IL-6的表達(dá),結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,DN組小鼠這3種促炎因子的表達(dá)均明顯升高。6.Tim-3阻斷可以條調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能無(wú)菌分離DN小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,提前用Anti-Tim3抗體預(yù)處理后,收集巨噬細(xì)胞,流式檢測(cè)TNF-α的表達(dá),結(jié)果顯示,Tim-3阻斷后,巨噬細(xì)胞TNF-α的表達(dá)明顯升高。[結(jié)論]糖尿病腎病患者及動(dòng)物模型單核/巨噬細(xì)胞中Tim-3表達(dá)明顯升高,且呈M1表型。提示Tim-3可能通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白樣分子-3 糖尿病腎病 巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號(hào)說(shuō)明13-14
• 前言14-17
• 材料和方法17-33
• 結(jié)果33-35
• 討論35-37
• 結(jié)論37-38
• 附表38-39
• 附圖39-46
• 參考文獻(xiàn)46-51
• 綜述51-59
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 致謝59-60
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文60-61
• 附件61

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7 姜e，

本文編號(hào)：871722