本文關(guān)鍵詞：雌激素調(diào)控破骨細胞TRPV5表達的分子機制研究

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【摘要】：目的:1.雌激素(E2)激活破骨細胞TRPV5基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域的確定。2.AP-1、SP1和NF-κB介導(dǎo)E2調(diào)控破骨細胞TRPV5的表達。方法:1.通過PCR獲得TRPV5基因包含5’UTR及其上游啟動子區(qū)域特定大小的片段,分別為2000bp,1000bp,500bp和150bp,連入p GL3-basic質(zhì)粒,構(gòu)建受小鼠TRPV5基因啟動子驅(qū)動的熒光素酶報告基因質(zhì)粒Trpv5-2k-luci,Trpv5-1k-luci,Trpv5-500-luci和Trpv5-150-luci,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式,轉(zhuǎn)染Raw264.7細胞,分析E2刺激前后的熒光素酶表達活性,尋找出受雌激素調(diào)控的TRPV5基因轉(zhuǎn)錄激活作用最強的區(qū)域。2.構(gòu)建AP-1、SP1和NF-κB的RNAi載體,將AP-1、SP1和NF-κB的RNAi載體分別與Trpv5-500-luci質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Raw264.7細胞,對轉(zhuǎn)染后細胞進行誘導(dǎo)分化,予以E2刺激。(1)觀察E2刺激后Raw264.7細胞雙熒光素酶活性變化情況。(2)應(yīng)用Real-time PCR技術(shù),檢測E2刺激后Raw264.7細胞TRPV5基因的轉(zhuǎn)錄表達情況。(3)在沉默了NF-κB實驗組中應(yīng)用Western-blot,檢測E2刺激后Raw264.7細胞中TRPV5基因的蛋白表達情況。(4)在沉默了NF-κB實驗組中應(yīng)用Ch IP技術(shù),檢測E2刺激后Raw264.7細胞中TRPV5基因的免疫沉淀表達量。結(jié)果:1.E2刺激后,轉(zhuǎn)染了熒光素酶報告基因質(zhì)粒Trpv5-2k-luci,Trpv5-1k-luci,Trpv5-500-luci和Trpv5-150-luci后的RAW264.7細胞,都有較明顯的熒光素酶活性表達。統(tǒng)計學(xué)分析顯示:轉(zhuǎn)染了Trpv5-2k-lucia,Trpv5-1k-lucib以及Trpv5-500-lucic的Raw264.7細胞熒光素酶活性明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(a:p=0.011,b:p=0.005,c:p=0.002)。轉(zhuǎn)染了Trpv5-150-lucid的Raw264.7細胞熒光酶素酶活性與對照組相比也有所升高,但無統(tǒng)計學(xué)差異(d:p=0.415)。組間分析顯示轉(zhuǎn)染Trpv5-150-luci的Raw264.7細胞的熒光素酶活性與轉(zhuǎn)染Trpv5-2k-lucie,Trpv5-1k-lucif以及Trpv5-500-lucig的Raw264.7細胞的熒光素酶活性相比,出現(xiàn)了較明顯的降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(e:p=0.08,f:p=0.037,g:p=0.022)。轉(zhuǎn)染Trpv5-2k-lucih,Trpv5-1k-lucii以及Trpv5-500-lucij的Raw264.7細胞,三組之間雙熒光素酶活性的表達無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(h,i:p=0.641;h,j:p=0.438;i,j:p=0.749)。結(jié)果表明,TRPV5基因啟動子在500bp至2000bp范圍內(nèi)都具備完整的啟動子活性,但當啟動子片段截短到150bp時,熒光素酶活性出現(xiàn)了明顯的降低。說明TRPV5基因啟動子500bp長度可能是其具備轉(zhuǎn)錄活性的必備區(qū)段。2.(1)統(tǒng)計學(xué)分析顯示:與對照組相比,沉默轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子AP-1,SP1以及NF-κB后,檢測到共轉(zhuǎn)染后的RAW264.7細胞熒光素酶活性均出現(xiàn)了明顯的下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(沉默AP-1,p=0.008;沉默SP1,p=0.006;沉默NF-κB,p=0.001)。組間分析顯示沉默NF-κB雙熒光素酶活性下降最為明顯。結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子AP-1,SP1,NF-κB均參與了E2刺激下破骨細胞TRPV5的表達調(diào)控,其中NF-κB在E2調(diào)控破骨細胞TRPV5的表達中可能占最主要的作用。(2)對實驗各組中RAW264.7細胞TRPV5基因的轉(zhuǎn)錄情況分析顯示:1.正常陽性對照組(E2)TRPV5 m RNA表達明顯,與Mock組相比,具有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.000)。說明E2能夠有效刺激破骨細胞TRPV5的轉(zhuǎn)錄。2.實驗組E2+si AP-1*,E2+si SP-1**和E2+si NF-κB***與陽性對照組(E2)相比,三組實驗中TRPV5 m RNA表達明顯下降,下降程度具有統(tǒng)計學(xué)差異(*:p=0.001,**:p=0.000,***:p=0.000),說明沉默轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子AP-1、SP1和NF-κB后,在E2刺激下破骨細胞TRPV5的轉(zhuǎn)錄明顯被抑制,表明轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子AP-1、SP1和NF-κB在E2刺激破骨細胞TRPV5基因的表達過程中均起作用。3.實驗組E2+si AP-1#,E2+si SP-1##和E2+si NF-κB###與Mock組相比,TRPV5 m RNA相對較明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(#:p=0.001,##:p=0.000,###:p=0.000),說明在特異性沉默其中某一個轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子后,另外兩個轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子仍起作用,進一步說明AP-1、SP1和NF-κB在E2刺激破骨細胞TRPV5基因的轉(zhuǎn)錄活動中均起作用。(3)Western-blot檢測顯示:1.E2實驗組中TRPV5蛋白的電泳條帶均勻單一,與Mock比較顯得較寬較長,說明E2能夠有效的刺激破骨細胞TRPV5蛋白的表達。2.在E2+si NF-κB實驗組中,沉默轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子NF-κB后,蛋白電泳條帶清晰,分布均勻,與Mock組相比條帶較寬長,但和E2+si NC及E2組比條帶則較窄短。說明TRPV5的蛋白表達在E2+si NF-κB實驗組中較Mock組多,但比E2+si NC和E2組少。表明轉(zhuǎn)錄結(jié)合參與NF-κB被特異性的沉默后,TRPV5基因的蛋白表達量出現(xiàn)了下降,但仍存在其他如AP-1,SP1等轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點參與介導(dǎo)E2調(diào)控破骨細胞TRPV5基因的蛋白表達。(4)Ch IP檢測實驗顯示:E2+si NF-κB組與Mock組相比較,其條帶更寬,視野更透亮,但和E2+si NC組及E2組相比電泳條帶卻較窄,視野也較暗。說明E2+si NF-κB組TRPV5基因的免疫沉淀表達量,較Mock組多,但比E2+si NC和E2組少。結(jié)果說明沉默轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子NF-κB后,能夠與TRPV5基因有效結(jié)合的位點明顯減少,導(dǎo)致TRPV5基因的免疫沉淀表達量明顯降低,但仍存在其他轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點如AP-1,SP1等能參與介導(dǎo)E2調(diào)控破骨細胞TRPV5基因的表達。結(jié)論:1.TRPV5基因啟動子在500bp至2000bp范圍內(nèi)具備完整的啟動子活性,其中基因啟動子500bp范圍內(nèi)可能具備基因轉(zhuǎn)錄表達所需要的大部分轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點。2.AP-1、SP1和NF-κB在雌激素調(diào)控TRPV5的轉(zhuǎn)錄激活中均起作用,其中NF-κB可能起主要作用。
【關(guān)鍵詞】：TRPV5 雌激素 破骨細胞 AP-1 SP1 NF-κB
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R580
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-10
• 縮略詞表10-11
• 前言11-14
• 第一部分 雌激素激活破骨細胞TRPV5基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域的確定14-26
• 一、實驗材料14-18
• 二、實驗方法18-24
• 三、實驗結(jié)果24-25
• 四、討論25-26
• 第二部分 AP-1、SP1和NF-κB介導(dǎo)E2調(diào)控破骨細胞TRPV5的表達26-48
• 一、實驗材料27-29
• 二、實驗方法29-41
• 三、實驗結(jié)果41-45
• 四、討論45-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻49-51
• 綜述 TRPV5介導(dǎo)雌激素抑制破骨細胞骨吸收作用的研究進展51-57
• 參考文獻54-57
• 碩士在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況57-58
• 致謝58

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本文編號：860117