本文關(guān)鍵詞：兔抗小鼠TSPAN33抗體的制備及其在STZ誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型中的作用研究

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【摘要】：背景及目的：TSPAN33是四跨膜蛋白超家族成員。有報(bào)道其高表達(dá)于許多自身免疫病患者活化的B細(xì)胞表面,而在T細(xì)胞、NK細(xì)胞以及靜息狀態(tài)的B細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。尤其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)及非霍奇金淋巴瘤患者的B細(xì)胞表面高表達(dá)TSPAN33,因此上述特性可作為這些疾病臨床診療的標(biāo)志物。而在自身免疫性糖尿病的B細(xì)胞表面TSPAN33是否表達(dá)及其意義迄今仍未知,因此本課題擬圍繞B細(xì)胞表面TSPAN33蛋白能否作為免疫治療靶點(diǎn)進(jìn)行初步探討。方法：1、小鼠TSPAN33基因的克隆、表達(dá)及純化：用Trizol法從小鼠PBMC中提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后通過PCR擴(kuò)增獲得TSPAN33基因,并將其重組到pET-28a質(zhì)粒中；將重組質(zhì)粒pET28a/TSPAN33轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3),誘導(dǎo)表達(dá)后用Ni2+-NTA凝膠柱進(jìn)行親和層析純化,并用含200 mmol/L咪唑的緩沖液進(jìn)行洗脫純化,行SDS-PAGE電泳分析鑒定；2、兔抗小鼠TSPAN33抗體的制備、純化及鑒定：使用500μg/mL,200μL純化后的蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化后免疫新西蘭白兔,并分別3、7、14、24和48天分別加強(qiáng)免疫1次,在第60天獲取兔抗鼠TSPAN33多克隆抗體,通過由磁珠耦聯(lián)合成的多肽片段純化得到抗體,用Western blot檢測制備抗體的特異性和ELISA檢測抗體效價(jià)；3、STZ誘導(dǎo)ICR小鼠糖尿病模型小鼠：將12只ICR小鼠采用連續(xù)5天腹腔注射6 mg/mL的STZ方式,以每只每次0.2 mL注射建模,誘導(dǎo)ICR小鼠發(fā)生糖尿病,測定小鼠血糖、胰島素、胰島素抗體等相關(guān)指標(biāo)；4、STZ誘導(dǎo)組與正常組小鼠血細(xì)胞中TSPAN33+B細(xì)胞比例檢測：從STZ誘導(dǎo)鼠和正常鼠中獲得外周血,流式細(xì)胞術(shù)分別檢測正常ICR小鼠和STZ誘導(dǎo)小鼠外周血細(xì)胞中TSPAN33+B細(xì)胞比例；5、抗TSPAN33抗體清除小鼠TSPAN33+B細(xì)胞：調(diào)整純化抗體濃度至300μg/mL,給予小鼠尾靜脈注射兔抗TSPAN33多抗100μL,連續(xù)監(jiān)測正常及STZ誘導(dǎo)組小鼠TSPAN33+B細(xì)胞的比例；以及血清中胰島素和胰島素抗體水平；6、TSPAN33抗體通過B淋巴細(xì)胞影響MIN6細(xì)胞胰島素基因表達(dá)：以免疫磁珠分選正常ICR和STZ誘導(dǎo)的ICR小鼠B淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測獲得純度；將分選的的B淋巴細(xì)胞分別與小鼠胰島瘤MIN6細(xì)胞共培養(yǎng),以MIN6細(xì)胞為空白對照孔,其余對應(yīng)孔中加入10μL300μg/mL的抗TSPAN33抗體,通過qRT-PCR分別檢測MIN6細(xì)胞胰島素基因的表達(dá)。結(jié)果：1、TSPAN 33基因經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳后,在約852bp處可見一條特異性條帶,測序結(jié)果顯示與預(yù)期擴(kuò)增的目的基因片段大小相符且無突變。將重組后的表達(dá)質(zhì)粒pET28a/TSPAN33轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后并純化得到TSPAN33蛋白。2、以免疫60天后的血清,經(jīng)過超濾濃縮及磁珠耦聯(lián)多肽純化,將純化后抗體經(jīng)ELISA進(jìn)行效價(jià)測定,發(fā)現(xiàn)純化后的兔抗鼠TSPAN33抗體效價(jià)為1：64000。3、通過對STZ誘導(dǎo)ICR小鼠的糖尿病指標(biāo)的監(jiān)測表明,表明已成功誘導(dǎo)了ICR小鼠的自身免疫性糖尿病模型；4、流式細(xì)胞檢測ICR小鼠外周血B細(xì)胞表面TSPAN33的表達(dá),結(jié)果顯示STZ誘導(dǎo)組小鼠TSPAN33+B細(xì)胞比例為(4.93±0.49)%高于對照組(1.82±0.19)%(***p0.001),且與人的檢測結(jié)果相似；5、使用兔抗鼠TSPAN33抗體濃度(300μg/mL),以每只小鼠注射100μl的量清除STZ誘導(dǎo)組小鼠外周血中TSPAN33+B細(xì)胞,結(jié)果顯示抗體刪除組小鼠較未處理組小鼠血清胰島素含量升高(**p0.01),而血清中IAA含量降低(**p0.01)。6、STZ誘導(dǎo)組小鼠B細(xì)胞與MIN6細(xì)胞共培養(yǎng),使用抗TSPAN33抗體處理組胰島素基因表達(dá)較未處理組顯著升高(*p0.05)。結(jié)論：本研究中,我們成功制備并純化出了較高效價(jià)的兔抗鼠TSPAN 33的多克隆抗體并以STZ成功誘導(dǎo)自身免疫性糖尿病小鼠模型。并且我們利用制備的抗體,通過減少模型小鼠外周血中TSPAN 33+B細(xì)胞比例,扭轉(zhuǎn)模型自身免疫型糖尿病小鼠糖尿病各項(xiàng)指標(biāo)。而且體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí),制備的多克隆抗體能夠通過降低TSPAN33+B淋巴細(xì)胞對MIN6細(xì)胞的影響,從而增加胰島素基因的表達(dá)。綜上所述TSPAN33+B細(xì)胞有望作為人類自身免疫病治療的靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：跨膜四蛋白33 I型糖尿病 B細(xì)胞 鏈脲佐菌素
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.1;R-332
【目錄】：

• 中英文縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 1 前言12-15
• 2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及流程15-16
• 3 實(shí)驗(yàn)材料16-21
• 4 實(shí)驗(yàn)方法21-30
• 5 結(jié)果30-42
• 6 討論42-43
• 7 結(jié)論43-44
• 8 參考文獻(xiàn)44-49
• 附錄49-50
• 致謝50-51
• 綜述51-61
• 參考文獻(xiàn)57-61

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