本文關(guān)鍵詞：TNF-α對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響及相關(guān)分子機(jī)制的探討

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【摘要】：目的:通過探討炎癥因子TNF-α對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成脂分化的影響及相關(guān)的分子機(jī)制,為臨床治療和預(yù)防肥胖相關(guān)代謝性疾病提供理論基礎(chǔ)。方法:(1)采用全骨髓細(xì)胞貼壁法分離、純化和培養(yǎng)SD大鼠BMSCs。(2)使用生長良好的第3代(P3)SD大鼠BMSCs進(jìn)行成脂、成骨分化誘導(dǎo),鑒定BMSCs多向分化的能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測BMSCs表面標(biāo)志物CD90、CD44、CD45、CD29、CD11b的表達(dá)。(3)MTT法檢測不同濃度TNF-α(1、10、20、50、100ng/ml)在不同培養(yǎng)時(shí)間(24h、48h、72h)對BMSCs增殖的影響;油紅O染色及異丙醇萃取后檢測OD值觀察不同濃度TNF-α(1、10、20、50、100ng/ml)對SD大鼠BMSCs成脂分化的影響。(4)將SD大鼠BMSCs分為對照組(Con組)、成脂誘導(dǎo)組(Ad組)和10ng/mL TNF-α干預(yù)成脂誘導(dǎo)組(Ad+TNFα組),分別于培養(yǎng)的第3、7、14天收集各組的細(xì)胞RNA,RT-PCR檢測各組基因wnt10b、前體脂肪細(xì)胞因子-1(Preadipocytes factor-1,Pref-1)、CCAAT區(qū)增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-α(CCAAT/enhancer-binding protein-α,C/EBP-α)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ)、脂肪酸結(jié)合蛋白-4(fattyacidbindingprotein-4,fabp-4)的mrna在不同培養(yǎng)時(shí)間下的表達(dá)水平。(5)于第14天收集3組細(xì)胞總蛋白,westernblot檢測細(xì)胞中β-catenin、ppar-γ、c/ebp-α、fabp-4的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:(1)全骨髓貼壁法分離、純化和培養(yǎng)的細(xì)胞為長梭形,核大,核仁2-3個(gè),清晰可見,呈典型的漩渦狀生長;具有成骨、成脂分化潛能,流式細(xì)胞術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn),細(xì)胞陽性表達(dá)cd29、cd90、cd44,陰性表達(dá)cd45、cd11b。(2)mtt結(jié)果顯示,tnf-α對sd大鼠bmscs增殖的抑制作用呈時(shí)間-劑量依賴關(guān)系。從培養(yǎng)的第48h開始,相同時(shí)間下,細(xì)胞增殖率與tnf-α濃度呈負(fù)相關(guān);相同濃度下,細(xì)胞增殖率與培養(yǎng)時(shí)間呈反比。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,較高濃度(20-100ng/ml)的tnf-α對bmscs增殖率抑制的影響無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。(3)油紅o染色和od值結(jié)果顯示,tnf-α可以抑制bmscs的脂肪分化,該抑制作用與濃度呈正相關(guān)。(4)rt-pcr結(jié)果顯示,在ad+tnfα組,隨著時(shí)間的延長,wnt10b、pref-1的mrna水平明顯增加并高于con組和ad組(p0.05),而c/ebp-α、ppar-γ、fabp-4的mrna水平則顯著低于ad組。westernblot結(jié)果顯示,誘導(dǎo)14天后,ad+tnfα組c/ebp-α、ppar-γ、fabp-4的蛋白水平明顯低于ad組(p0.05)。磷酸化的β-catenin(p-β-catenin)蛋白水平也顯著低于ad組(p0.05)。結(jié)論:(1)多向分化功能鑒定和流式細(xì)胞鑒定結(jié)果可知,實(shí)驗(yàn)中分離、純化和培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。(2)tnf-α對sd大鼠bmscs增殖的抑制作用呈時(shí)間-濃度依賴關(guān)系;tnf-α可以抑制sd大鼠BMSCs的脂肪分化,該抑制作用與其濃度呈正相關(guān)。(3)TNF-α通過激活wnt/β-catenin信號(hào)通路,抑制成脂關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C/EBP-α、PPAR-γ的表達(dá),發(fā)揮對SD大鼠BMSC成脂過程的抑制作用。而TNF-α促進(jìn)Pref-1表達(dá)又提示我們,TNF-α的抑制效應(yīng)可能只作用于分化相,而對決定相沒有影響。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 成脂分化 炎癥因子 wnt/β-catenin信號(hào)通路 Pref-1
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R589
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-13
• 實(shí)驗(yàn)一 SD大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定13-22
• 1 材料和方法13-19
• 2 結(jié)果19-21
• 3 討論21-22
• 實(shí)驗(yàn)二 不同濃度TNF-α 對BMSCs細(xì)胞增殖和成脂分化的影響22-28
• 1 材料和方法22-25
• 2 結(jié)果25-27
• 3 討論27-28
• 實(shí)驗(yàn)三 TNF-α 對SD大鼠BMSCs成脂相關(guān)基因的表達(dá)和wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響28-39
• 1 材料和方法28-35
• 2 結(jié)果35-37
• 3 討論37-39
• 全文總結(jié)39-40
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 文獻(xiàn)綜述43-54
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 致謝54-55
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文55

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