本文關(guān)鍵詞：鴉膽子苦醇對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖、凋亡和運動能力調(diào)控的研究

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【摘要】：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以滑膜炎為主要特征的慢性自身免疫性疾病,能夠侵犯全身各處的關(guān)節(jié),呈現(xiàn)多發(fā)性和對稱性。RA的病理情況主要表現(xiàn)為滑膜增生、軟骨和骨的破壞、大量炎性細(xì)胞浸潤以及微血管的新生。RA能夠引起關(guān)節(jié)的疼痛和僵硬,甚至對關(guān)節(jié)進行嚴(yán)重的破壞。RA的病發(fā)原因復(fù)雜多樣并涉及淋巴細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞類型,其中類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞(Rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA FLS)作為一種“類腫瘤樣”細(xì)胞,在RA的發(fā)生和發(fā)展中起到了非常關(guān)鍵的作用。一方面,RA FLS的過度增殖和異常的凋亡能夠造成滑膜增厚,在炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞中發(fā)揮作用。另一方面,RA FLS表現(xiàn)出異常的遷移和侵襲能力,產(chǎn)生蛋白水解酶等對細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)進行降解并造成軟骨和骨的破壞進而導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形甚至關(guān)節(jié)功能喪失。鴉膽子苦醇(Brusatol)是近幾年腫瘤相關(guān)研究中表現(xiàn)出良好抑癌作用的潛力藥物,其能夠有效地抑制腫瘤的形成和生長,具有良好的抗炎癥作用,并且在我國的中醫(yī)藥的運用中鴉膽子苦醇也取得了滿意的效果。作為“類腫瘤樣”細(xì)胞的RA FLS在其細(xì)胞學(xué)行為方面與腫瘤細(xì)胞有著相似的特點,因此在本課題中,我們把鴉膽子苦醇首次運用到RA的研究中,來探究鴉膽子苦醇對RA FLS的影響并進行相關(guān)機制的探索。本課題中采用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和生物力學(xué)等技術(shù)手段與方法,探究鴉膽子苦醇對RA FLS的增殖、凋亡、遷移、侵襲和力學(xué)性質(zhì)的影響,并對相關(guān)機制進行初步探索。主要工作和結(jié)論如下:(1)采用組織塊培養(yǎng)法分離提取RA FLS,采用結(jié)晶紫染色方法和細(xì)胞骨架染色方法對細(xì)胞進行形態(tài)觀察,采用Western blotting方法檢測細(xì)胞中RA的標(biāo)志物CHI3L1的表達(dá)情況。結(jié)果表明,細(xì)胞傳代至第3代便可得到形態(tài)均一的呈梭形的成纖維樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS),并且卵圓形的細(xì)胞核位于細(xì)胞中央,細(xì)胞具有偽足結(jié)構(gòu)。與人正常成纖維樣滑膜細(xì)胞相比,分離提取的細(xì)胞中CHI3L1顯著性增加。提示采用組織塊培養(yǎng)法獲得了呈梭形的RA FLS。(2)采用MTS方法、EdU方法和Western blotting方法檢測鴉膽子苦醇對RA FLS的毒性、增殖和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-8的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在本課題中鴉膽子苦醇所采用的濃度范圍(0~80nM)內(nèi),鴉膽子苦醇對RA FLS沒有毒性。鴉膽子苦醇能夠抑制RA FLS的增殖并且可以上調(diào)Caspase-3和Caspase-8的表達(dá),促進RA FLS的凋亡。(3)采用Transwell細(xì)胞小室方法、細(xì)胞骨架染色方法和原子力顯微鏡(Atomic force microscope,AFM)方法檢測鴉膽子苦醇對細(xì)胞的遷移、侵襲、細(xì)胞骨架和細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),鴉膽子苦醇能夠抑制RA FLS的遷移和侵襲行為。鴉膽子苦醇能夠降低RA FLS板狀偽足和絲狀偽足的產(chǎn)生,降低RA FLS的運動能力。鴉膽子苦醇增加RA FLS的楊氏模量,提高細(xì)胞的硬度,降低細(xì)胞的變形和運動能力。(4)采用Western blotting方法、實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)方法、酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法和酶譜方法檢測鴉膽子苦醇對與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2、pERK、CHI3L1、MMPs、N-WASP、肌動蛋白結(jié)合蛋白和整合素表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),鴉膽子苦醇能夠上調(diào)Nrf2的表達(dá),抑制ERK的磷酸化水平,下調(diào)CHI3L1、MMPs、N-WASP、肌動蛋白結(jié)合蛋白和整合素的表達(dá)。綜上所述,本課題研究表明,鴉膽子苦醇可抑制RA FLS的增殖、促進RA FLS的凋亡并且抑制RA FLS的遷移、侵襲和變形與運動能力,這與鴉膽子苦醇調(diào)節(jié)與細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等細(xì)胞行為相關(guān)的Nrf2、pERK、MMPs、CHI3L1、N-WASP、肌動蛋白結(jié)合蛋白和整合素有一定聯(lián)系,提示鴉膽子苦醇在RA的緩解和治療方面具有良好的應(yīng)用前景和價值。
【關(guān)鍵詞】：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 鴉膽子苦醇 增殖 凋亡 運動能力
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R593.22
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-10
• 縮略詞表10-11
• 1 緒論11-17
• 1.1 問題的提出和研究意義11-14
• 1.1.1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎11-12
• 1.1.2 滑膜組織的生理學(xué)和病理學(xué)情況12
• 1.1.3 RA中的FLS的情況12-13
• 1.1.4 鴉膽子苦醇13-14
• 1.2 研究的目的和內(nèi)容14-17
• 2 人成纖維樣滑膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)和觀察17-29
• 2.1 引言17
• 2.2 實驗材料17-22
• 2.2.1 實驗細(xì)胞17-18
• 2.2.2 主要材料和儀器設(shè)備18-19
• 2.2.3 主要試劑19-20
• 2.2.4 主要試劑配制方法20-22
• 2.3 實驗方法22-25
• 2.3.1 成纖維樣滑膜細(xì)胞的原代分離和培養(yǎng)22-23
• 2.3.2 結(jié)晶紫染色實驗檢測RA FLS形態(tài)23-24
• 2.3.3 細(xì)胞骨架染色實驗檢測RA FLS細(xì)胞骨架24
• 2.3.4 Western blotting實驗檢測RA FLS標(biāo)志物的表達(dá)24-25
• 2.4 實驗結(jié)果25-28
• 2.4.1 成纖維樣滑膜細(xì)胞的原代分離和培養(yǎng)25-26
• 2.4.2 RA FLS結(jié)晶紫染色和細(xì)胞骨架染色26-27
• 2.4.3 RA FLS標(biāo)志物的檢測27-28
• 2.5 討論28
• 2.6 本章小結(jié)28-29
• 3 鴉膽子苦醇對RA FLS增殖和凋亡的影響29-39
• 3.1 引言29
• 3.2 實驗材料29-31
• 3.2.1 實驗細(xì)胞29
• 3.2.2 主要材料和儀器設(shè)備29-30
• 3.2.3 主要試劑30
• 3.2.4 主要試劑配制方法30-31
• 3.3 實驗方法31-34
• 3.3.1 MTS實驗檢測鴉膽子苦醇對細(xì)胞毒性的影響31
• 3.3.2 EdU細(xì)胞增殖實驗檢測細(xì)胞增殖31-32
• 3.3.3 Western blotting實驗檢測細(xì)胞中蛋白表達(dá)32-34
• 3.4 實驗結(jié)果34-37
• 3.4.1 鴉膽子苦醇對細(xì)胞毒性的影響34
• 3.4.2 鴉膽子苦醇對細(xì)胞增殖的影響34-35
• 3.4.3 鴉膽子苦醇對細(xì)胞凋亡的影響35-37
• 3.5 討論37-38
• 3.6 本章小結(jié)38-39
• 4 鴉膽子苦醇對RA FLS運動能力的影響39-49
• 4.1 引言39
• 4.2 實驗材料39-41
• 4.2.1 實驗細(xì)胞39
• 4.2.2 主要材料和儀器設(shè)備39-40
• 4.2.3 主要試劑40-41
• 4.2.4 主要試劑配制方法41
• 4.3 實驗方法41-43
• 4.3.1 Transwell細(xì)胞小室實驗檢測細(xì)胞遷移41
• 4.3.2 Transwell細(xì)胞小室實驗檢測細(xì)胞侵襲41-42
• 4.3.3 細(xì)胞骨架熒光染色實驗檢測細(xì)胞骨架42-43
• 4.3.4 AFM實驗檢測細(xì)胞楊氏模量43
• 4.4 實驗結(jié)果43-46
• 4.4.1 鴉膽子苦醇對細(xì)胞遷移的影響43-44
• 4.4.2 鴉膽子苦醇對細(xì)胞侵襲的影響44-45
• 4.4.3 鴉膽子苦醇對細(xì)胞骨架的影響45
• 4.4.4 鴉膽子苦醇對細(xì)胞楊氏模量的影響45-46
• 4.5 討論46-47
• 4.6 本章小結(jié)47-49
• 5 鴉膽子苦醇對RA FLS細(xì)胞行為影響的機制探索49-75
• 5.1 引言49-51
• 5.2 實驗材料51-54
• 5.2.1 實驗細(xì)胞51
• 5.2.2 主要材料和儀器設(shè)備51-52
• 5.2.3 主要試劑52-53
• 5.2.4 主要試劑配制方法53-54
• 5.3 實驗方法54-64
• 5.3.1 Western blotting實驗檢測蛋白表達(dá)54-57
• 5.3.2 酶譜實驗檢測MMP-2 表達(dá)57-59
• 5.3.3 qPCR實驗檢測基因表達(dá)59-62
• 5.3.4 ELISA實驗檢測MMP-1 表達(dá)62-64
• 5.4 實驗結(jié)果64-72
• 5.4.1 鴉膽子苦醇對Nrf2表達(dá)的影響64-65
• 5.4.2 鴉膽子苦醇對pERK表達(dá)的影響65-66
• 5.4.3 鴉膽子苦醇對MMP-1 表達(dá)的影響66-68
• 5.4.4 鴉膽子苦醇對MMP-2 表達(dá)的影響68-70
• 5.4.5 鴉膽子苦醇對MMP-3 表達(dá)的影響70-71
• 5.4.6 鴉膽子苦醇對CHI3L1表達(dá)的影響71-72
• 5.4.7 鴉膽子苦醇對N-WASP、肌動蛋白結(jié)合蛋白和整合素表達(dá)的影響72
• 5.5 討論72-74
• 5.6 本章小結(jié)74-75
• 6 結(jié)論與展望75-77
• 6.1 主要結(jié)論75-76
• 6.2 工作展望76-77
• 致謝77-79
• 參考文獻(xiàn)79-85
• 附錄 作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文85

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 劉楠楠;趙薇;穆楠;田菲;薛曉暢;顏真;張偉;;類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜(FLS)細(xì)胞中DDR2相互作用分子的篩選鑒定及其對FLS細(xì)胞侵襲能力的影響[J];生物技術(shù)通訊;2015年03期

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3 范蓉;王新云;;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究進展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2014年11期

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6 李茹,栗占國;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗原的研究進展[J];中華風(fēng)濕病學(xué)雜志;2004年02期

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本文編號：824790