本文關(guān)鍵詞：Betatrophin重組腺病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建

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【摘要】：目的應(yīng)用基因同源重組技術(shù),構(gòu)建表達(dá)小鼠Betatrophin基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體,為進(jìn)一步研究Betatrophin的功能奠定基礎(chǔ)。方法根據(jù)GenBank中小鼠Betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)序列,經(jīng)化學(xué)合成得到含BamH I/Age I酶切位點(diǎn)的小鼠Betatrophin基因全長(zhǎng)c DNA質(zhì)粒,將其酶切后插入到帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的GV314載體CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP中,得到重組病毒穿梭質(zhì)粒pGV314-Betatrophin。利用Ad-Max包裝系統(tǒng),此重組穿梭質(zhì)粒與病毒基因組質(zhì)粒pBHG loxΔE1,3 Cre體外同源重組構(gòu)建含有目的基因的腺病毒載體Ad-Betatrophin,純化后轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞包裝重組病毒顆粒,經(jīng)在HEK293T細(xì)胞反復(fù)擴(kuò)增數(shù)代后,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、免疫印跡法(western blot)及測(cè)序來鑒定重組的腺病毒。結(jié)果(1)目的基因Betatrophin經(jīng)化學(xué)合成后雙酶切鑒定大小符合。(2)將雙酶切后的質(zhì)粒pcDNA3.1-Betatrophin和載體pGV314利用In-fusion克隆技術(shù),得到交換產(chǎn)物,即pGV314-Betatrophin重組穿梭質(zhì)粒,經(jīng)PCR、western blot及測(cè)序檢測(cè)表明腺病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。(3)病毒穿梭質(zhì)粒pGV314-Betatrophin和病毒基因組質(zhì)粒pBHG loxΔE1,3Cre經(jīng)在293T細(xì)胞中成功包裝出重組腺病毒質(zhì)粒pAd-Betatrophin。(4)重組腺病毒pAd-Betatrophin轉(zhuǎn)染293T后成功包裝出腺病毒,經(jīng)擴(kuò)增、純化獲得的病毒滴度為1×1010.2pfu/ml。結(jié)論成功構(gòu)建了攜帶小鼠Betatrophin基因的重組穿梭質(zhì)粒,并且轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后成功包裝出重組腺病毒Ad-Betatrophin,這有助于進(jìn)一步研究Betatrophin的功能。
【關(guān)鍵詞】：Betatrophin 腺病毒載體 同源重組
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.1
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 英文縮寫索引8-12
• 第一章 緒論12-18
• 1.1 前言12-13
• 1.2 論文研究目的、實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)方案的選擇和臨床意義13-18
• 1.2.1 研究目的13
• 1.2.2 研究主要內(nèi)容和方法13-15
• 1.2.3 實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)15-16
• 1.2.4 研究的臨床意義16-18
• 第二章 pGV314-betatrophin重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定18-40
• 2.1 試劑與儀器18-19
• 2.1.1 儀器18
• 2.1.2 藥品與試劑18-19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)溶液的配置19-22
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法22-31
• 2.3.1 含有小鼠Betatrophin基因質(zhì)粒的構(gòu)建22-24
• 2.3.2 穿梭質(zhì)粒pGV314酶切線性化24-26
• 2.3.3 目的基因連接于線性化載體pGV31426
• 2.3.4 交換產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞26-27
• 2.3.5 用于陽(yáng)性克隆鑒定的PCR引物設(shè)計(jì)27
• 2.3.6 pGV314-Betatrophin穿梭載體的鑒定27-28
• 2.3.7 HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)28
• 2.3.8 外源基因表達(dá)的鑒定28-31
• 2.4 結(jié)果31-35
• 2.4.1 帶有目的基因的pcDNA3.1 質(zhì)粒的鑒定31
• 2.4.2 重組穿梭質(zhì)粒pGV314-Betatrophin的鑒定31-32
• 2.4.3 重組質(zhì)粒Ad-Betatrophin蛋白表達(dá)檢測(cè)32-33
• 2.4.4 陽(yáng)性克隆DNA測(cè)序結(jié)果及結(jié)果分析33-34
• 2.4.5 用于陽(yáng)性克隆鑒定的PCR引物設(shè)計(jì)34-35
• 2.5 討論35-39
• 2.6 結(jié)論39-40
• 第三章 重組腺病毒Ad-Betatrophin的構(gòu)建及鑒定40-47
• 3.1 試劑與儀器40
• 3.1.1 儀器40
• 3.1.2 藥品與試劑40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法40-43
• 3.2.1 pGV314穿梭質(zhì)粒的抽提40-41
• 3.2.2 腺病毒質(zhì)粒的獲取41
• 3.2.3 人胚腎 293T細(xì)胞的培養(yǎng)41
• 3.2.4 重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增、純化41-43
• 3.2.5 腺病毒滴度測(cè)定-終點(diǎn)稀釋法43
• 3.3 結(jié)果43-44
• 3.3.1 重組腺病毒的收獲43-44
• 3.3.2 病毒滴度測(cè)定44
• 3.4 討論44-46
• 3.5 結(jié)論46-47
• 展望47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 綜述52-65
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 致謝65-67
• 攻讀碩士期間發(fā)表文章67-68
• 附錄68

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