本文關(guān)鍵詞：廣西巴馬小型豬HSL基因表達(dá)與2型糖尿病的相關(guān)性研究

  更多相關(guān)文章： 廣西巴馬小型豬 2型糖尿病 HSL基因 脂肪代謝 胰島素

【摘要】：糖尿病作為嚴(yán)重危害人類健康的慢性非傳染性疾病,其患病率呈逐年上升趨勢,其中以2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)為主。脂代謝異常是誘發(fā)T2DM的重要因素之一。激素敏感性脂肪酶(Hormone sensitive lipase, HSL)是脂肪甘油三酯水解的關(guān)鍵酶和限速酶,在脂肪代謝過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。HSL在肥胖及胰島素抵抗(insulin resistance,IR)發(fā)生過程中有重要作用。但關(guān)于HSL在T2DM發(fā)生過程中的作用機(jī)制研究較少。本實驗通過檢測高脂高糖誘導(dǎo)的T2DM發(fā)病組、未發(fā)病組和正常飼喂的對照組的廣西巴馬小型豬脂肪組織和胰腺組織中HSL基因及其相關(guān)基因的表達(dá)水平,血清生化指標(biāo)及胰島素(Insulin, INS)水平,以及過表達(dá)HSL基因?qū)?T3-L1細(xì)胞和pTC-6細(xì)胞的影響,從動物和細(xì)胞水平初步研究HSL在2型糖尿病發(fā)生中的作用途徑。1.比較分析T2DM組(6頭)、未發(fā)病組(6頭)和對照組(4頭)廣西巴馬小型豬的血清生化指標(biāo)和胰島素水平。結(jié)果表明,T2DM組的FBG和INS水平均顯著高于對照組(P0.05),未發(fā)病組的TG、TC、HDL和LDL水平都顯著高于對照組,T2DM組的TG和HDL水平顯著低于未發(fā)病組。飼喂高脂高糖日糧能顯著改變小型豬血清生化指標(biāo)和胰島素水平,有向T2DM方向發(fā)展的趨勢。2.利用QRT-PCR技術(shù)檢測實驗組和對照組巴馬小型豬的HSL基因及其相關(guān)基因(ATGL、MGL、LPL、FASN、PPARγ)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,廣西巴馬小型豬的心、肝、脾、腎、胰、背最長肌、皮下脂肪組織中均檢測到HSL基因表達(dá),其中在皮下脂肪中HSL基因表達(dá)豐度最高。在皮下脂肪中,T2DM組的LPL基因表達(dá)水平顯著高于未發(fā)病組和對照組,FASN基因的表達(dá)水平顯著低于后兩組,HSL基因表達(dá)水平顯著低于未發(fā)病組,PPARy基因表達(dá)水平顯著低于對照組。在胰腺組織中,T2DM組和未發(fā)病組的HSL和INS基因表達(dá)水平顯著高于對照組,T2DM組INS基因表達(dá)水平顯著高于未發(fā)病組。3.根據(jù)GenBank公布的豬HSL基因CDS序列設(shè)計引物,擴(kuò)增廣西巴馬小型豬HSL基因CDS序列,進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示,廣西巴馬小型豬HSL基因CDS序列長2295bp,與參考序列的同源性為99.9%；存在3處堿基的錯義突變,1427 T→A引起HSL的第476位Leu→His,1801 A→G引起第601位Thr→Ala,1933 A→T引起第645位Arg→Trp。對廣西巴馬小型豬HSL的蛋白預(yù)測發(fā)現(xiàn),HSL具有很強(qiáng)的疏水性,有高含量的α螺旋及無規(guī)則卷曲,較低含量的p折疊,具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域,這可能與HSL作為脂肪酶類有關(guān)。成功構(gòu)建了PLV-HSL慢病毒表達(dá)載體,為后續(xù)細(xì)胞實驗奠定了基礎(chǔ)。4.在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞和pTC-6細(xì)胞中過表達(dá)HSL基因。結(jié)果顯示,將PLV-HSL重組慢病毒載體質(zhì)粒和PLV空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞,過表達(dá)HSL,可顯著上調(diào)MGL基因表達(dá)。誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化過程中,相對于PLV組,PLV-HSL組HSL、C/EBPα、MGL、LPL、aP2、ATGL、 FASN基因的相對表達(dá)水平呈協(xié)同變化趨勢；從誘導(dǎo)分化后的第4天(Day4)起,PLV-HSL組細(xì)胞培養(yǎng)液中TG濃度顯著低于PLV組。將PLV-HSL質(zhì)粒和PLV質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染pTC-6細(xì)胞,HSL基因過表達(dá),可刺激INS基因的表達(dá)。但是,PLV-HSL轉(zhuǎn)染βTC-6細(xì)胞48h和72h,細(xì)胞培養(yǎng)液中INS濃度顯著低于PLV組。在食物誘導(dǎo)廣西巴馬小型豬建立2型糖尿病模型過程中,高脂高糖日糧刺激脂肪合成關(guān)鍵基因(LPL)表達(dá)顯著上調(diào),抑制脂肪分解代謝相關(guān)基因(HSL)表達(dá),引發(fā)機(jī)體肥胖和脂肪代謝障礙；高脂高糖日糧能刺激胰腺組織HSL基因的表達(dá),顯著上調(diào)INS基因表達(dá),小型豬血清中胰島素濃度增加,長時間維持高水平的血清胰島素,引發(fā)胰島素抵抗。脂肪代謝障礙和胰島素抵抗是誘發(fā)T2DM發(fā)生的主要病因。研究結(jié)果表明,HSL在2型糖尿病發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：廣西巴馬小型豬 2型糖尿病 HSL基因 脂肪代謝 胰島素
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.1
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 縮寫詞中英文對照14-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-20
• 1.1 2型糖尿病的研究進(jìn)展15
• 1.2 廣西巴馬小型豬2型糖尿病動物模型15-16
• 1.3 HSL基因簡介16-17
• 1.4 HSL的生物學(xué)功能17-18
• 1.5 HSL與2型糖尿病的關(guān)系18-19
• 1.6 脂代謝相關(guān)基因功能簡介19
• 1.7 本研究的目的意義19-20
• 第二章 廣西巴馬小型豬HSL及其相關(guān)基因的表達(dá)分析20-31
• 2.1 實驗材料20-21
• 2.1.1 試驗樣品20
• 2.1.2 主要試劑20
• 2.1.3 主要儀器20-21
• 2.2 實驗方法21-24
• 2.2.1 檢測廣西巴馬小型豬血清的生化指標(biāo)21
• 2.2.2 廣西巴馬小型豬組織總RNA的提取和cDNA合成21-23
• 2.2.3 實時熒光定量PCR檢測HSL基因的表達(dá)23-24
• 2.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析24
• 2.3 實驗結(jié)果與分析24-28
• 2.3.1 血清生理生化指標(biāo)及胰島素水平24-25
• 2.3.2 組織總RNA提取結(jié)果25-26
• 2.3.3 HSL基因的組織表達(dá)譜分析26
• 2.3.4 皮下脂HSL基因及脂肪代謝分化相關(guān)基因的相對表達(dá)結(jié)果26-27
• 2.3.5 胰腺組織HSL基因和INS基因的相對表達(dá)結(jié)果27-28
• 2.4 討論28-30
• 2.5 小結(jié)30-31
• 第三章 廣西巴馬小型豬HSL基因的克隆、生物信息學(xué)分析及慢病毒載體的構(gòu)建31-47
• 3.1 實驗材料31-33
• 3.1.1 試驗樣品31
• 3.1.2 載體及菌株31
• 3.1.3 主要試劑及儀器31-32
• 3.1.4 試劑的配制32-33
• 3.2 實驗方法33-37
• 3.2.1 廣西巴馬小型豬皮下脂總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA33-34
• 3.2.2 引物的設(shè)計與合成34
• 3.2.3 PCR擴(kuò)增HSL基因34
• 3.2.4 目的片段與pMD18-T載體連接34
• 3.2.5 pMD18-T-HSL重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化34-35
• 3.2.6 pMD18-T-HSL重組質(zhì)粒的鑒定35
• 3.2.7 廣西巴馬小型豬HSL基因的生物信息學(xué)分析35-36
• 3.2.8 pMD18-T-HSL重組質(zhì)粒和慢病毒載體PLV的雙酶切36
• 3.2.9 雙酶切產(chǎn)物的膠回收純化36
• 3.2.10 T4連接36-37
• 3.2.11 PLV-HSL重組慢病毒載體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化37
• 3.2.12 PLV-HSL重組慢病毒載體質(zhì)粒的鑒定37
• 3.3 實驗結(jié)果與分析37-45
• 3.3.1 PCR擴(kuò)增HSL基因的結(jié)果37-38
• 3.3.2 pMD18-T-HSL重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果38-39
• 3.3.3 HSL基因的序列及生物信息學(xué)分析39-43
• 3.3.4 pMD18-T-HSL和PLV雙酶切結(jié)果43-44
• 3.3.5 PLV-HSL重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果44-45
• 3.4 討論45-46
• 3.5 小結(jié)46-47
• 第四章 過表達(dá)HSL對3T3-L1細(xì)胞和βTC-6細(xì)胞的影響47-62
• 4.1 實驗材料47-48
• 4.1.1 細(xì)胞來源47
• 4.1.2 主要試劑47-48
• 4.1.3 實驗儀器48
• 4.1.4 試劑的配制48
• 4.2 實驗方法48-52
• 4.2.1 PLV-HSL和PLV去內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取48
• 4.2.2 3T3-L1和βTC-6細(xì)胞的復(fù)蘇、凍存與傳代培養(yǎng)48-49
• 4.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3T3-L1和βTC-6細(xì)胞49-50
• 4.2.4 收集細(xì)胞提取總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA50
• 4.2.5 實時熒光定量PCR50-51
• 4.2.6 檢測轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞后培養(yǎng)基的TG含量51
• 4.2.7 ELISA檢測轉(zhuǎn)染βTC-6細(xì)胞后培養(yǎng)基的胰島素濃度51-52
• 4.3 實驗結(jié)果及分析52-58
• 4.3.1 去內(nèi)毒素質(zhì)粒的檢測52
• 4.3.2 轉(zhuǎn)染前細(xì)胞形態(tài)觀察52
• 4.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果52-54
• 4.3.4 轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞后誘導(dǎo)細(xì)胞分化結(jié)果54-55
• 4.3.5 轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞后各基因相對表達(dá)結(jié)果55-56
• 4.3.6 轉(zhuǎn)染βTC-6細(xì)胞HSL基因和INS基因的相對表達(dá)結(jié)果56-57
• 4.3.7 3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)基的TG含量測定結(jié)果57-58
• 4.3.8 βTC-6細(xì)胞培養(yǎng)基的胰島素濃度測定結(jié)果58
• 4.4 討論58-60
• 4.5 小結(jié)60-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-69
• 附錄69-73
• 致謝73-74
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文74

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