本文關(guān)鍵詞：Hedgehog信號通路在慢性氟中毒大鼠軟骨損害中的作用及其機(jī)制

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【摘要】：目的:通過體內(nèi)外染氟實(shí)驗(yàn)及體外Smo siRNA阻斷Hh信號通路,觀察氟致大鼠軟骨損害中Hh信號通路相關(guān)因子表達(dá)水平變化及軟骨細(xì)胞凋亡情況,以探討氟中毒致軟骨損傷的發(fā)病機(jī)制,為地氟病的預(yù)防及治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:(1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):36只健康SD大鼠按體重隨機(jī)分為對照組(飲用含氟量1 mg/L自來水)、低氟組、高氟組(飲水含氟量分別為5 mg/L、50 mg/L),每組12只(雌雄各半)。飼養(yǎng)6個(gè)月后,股動(dòng)脈放血處死,應(yīng)用氟離子電極法檢測各組大鼠尿氟、骨氟含量;HE染色后光鏡觀察關(guān)節(jié)軟骨組織病理形態(tài)學(xué)的改變;IHC和Wb法檢測軟骨組織Hh信號通路中Shh、Smo、BMP-2及凋亡相關(guān)調(diào)控蛋白Bcl-2及Bax表達(dá)情況。(2)體外實(shí)驗(yàn):取1周齡健康SD大鼠4只,用機(jī)械-酶消化法分離關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞;甲苯胺藍(lán)對原代軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定,常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng),待細(xì)胞傳至2代細(xì)胞融合至70%時(shí),分別加入濃度為0(對照組)、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mM的含氟培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)72 h后采用MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖情況,篩選出最適氟濃度;以慢病毒為載體將Smo siRNA1~3轉(zhuǎn)入軟骨細(xì)胞,72 h后,Wb檢測Smo表達(dá)含量,篩選出抑制作用最強(qiáng)片段后將實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、氟中毒組、control siRNA(陰性對照)組及Smo siRNA組;各組細(xì)胞培養(yǎng)72h后采用Wb檢測Shh、Smo、BMP-2、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況;逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測Shh、Smo、BMP-2 mRNA表達(dá)水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率。結(jié)果:1、低氟組及高氟組的尿氟、骨氟(3.66±0.43、402.38±33.77;8.05±0.60、935.12±49.60)含量均較對照組(1.12±0.16、106.45±11.28)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);2、HE結(jié)果顯示,對照組大鼠軟骨邊緣基本整齊,細(xì)胞呈柱狀排列。隨著染氟劑量增加,各染氟組干骺端出現(xiàn)不同程度軟骨骨化,骨小梁增寬,具有硬化性氟骨癥改變。3、Wb結(jié)果顯示,低氟組、高氟組Shh、Smo、BMP-2及Bax蛋白表達(dá)(0.86±0.09、0.92±0.11、1.02±0.10、0.91±0.14;1.11±0.15、1.17±0.15、1.13±0.12、0.92±0.11)較對照組(0.62±0.07、0.74±0.09、0.77±0.11、0.63±0.06)升明顯升高,Bcl-2蛋白表達(dá)(0.78±0.03;0.57±0.09)較對照組(0.84±0.10)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、原代軟骨細(xì)胞提取成功,表現(xiàn)為經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色時(shí),細(xì)胞內(nèi)可見紫紅色的異染顆粒。5、MTT結(jié)果顯示,染氟72 h后,濃度為0.125、0.25、0.5 mM組細(xì)胞活力(120.83±7.21、123.17±4.62、118.51±10.09)較對照組升高,濃度為1.0、2.0、4.0 mM組細(xì)胞活力(82.13±6.25、35.16±4.84、7.03±2.23)較對照組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6、Smo siRNA1~3均可不同程度抑制Smo因子的表達(dá),以Smo siRNA2片段抑制作用最強(qiáng)。7、Wb及逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示,氟中毒組與陰性對照組Shh、Smo及BMP-2蛋白(0.94±0.05、0.89±0.07、1.06±0.15;1.00±0.09、0.86±0.05、1.14±0.13)和mRNA(0.67±0.04、0.46±0.06、0.77±0.06;0.61±0.04、0.51±0.07、0.79±0.06)的表達(dá)較空白對照組(0.70±0.06、0.69±0.06、0.83±0.12;0.53±0.06、0.34±0.03、0.69±0.06)明顯升高,Smo siRNA組(0.52±0.03、0.47±0.06、0.59±0.06;0.42±0.05、0.28±0.06、0.50±0.03)與空白對照組及陰性對照組相比其表達(dá)均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8、流式結(jié)果顯示,與空白對照組細(xì)胞凋亡率相比(11.04±1.11),氟中毒組與陰性對照組細(xì)胞凋亡率(18.49±0.80;17.97±1.07)明顯升高,Smo siRNA組(40.32±1.79)升高更為明顯。與空白對照組Bax、Bcl-2的表達(dá)及Bax/Bcl-2的比值(0.88±0.06;1.05±0.07;0.85±0.09)相比,氟中毒組與陰性對照組Bax表達(dá)(1.07±0.10;1.19±0.12)升高,Bcl-2表達(dá)(0.74±0.03;0.76±0.05)降低,Bax/Bcl-2比值(1.45±0.13;1.56±0.15)升高,Smo siRNA組(1.39±0.10;0.50±0.03;2.29±0.21)變化更為明顯,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、氟中毒時(shí)軟骨組織可出現(xiàn)不同程度的骨化,具有硬化性氟骨癥的病理改變。2、在一定條件下,低濃度的氟對大鼠原代軟骨細(xì)胞具有促進(jìn)增殖作用,而高濃度具有促進(jìn)凋亡作用。3、Hh信號通路可能與凋亡以及其它因素共同參與氟致軟骨損傷的機(jī)制及發(fā)病過程。
【關(guān)鍵詞】：慢性氟中毒 Hh信號通路 軟骨細(xì)胞 慢病毒載體 siRNA
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R599.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-11
• 略縮詞表11-13
• 引言13-16
• 第一部分 慢性氟中毒大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織的病理形態(tài)學(xué)變化及Hh信號通路蛋白的表達(dá)16-31
• 材料與方法16-23
• 結(jié)果23-27
• 討論27-31
• 第二部分 慢病毒介導(dǎo)Smo siRNA對染氟軟骨細(xì)胞中Hh信號通路的影響31-50
• 材料與方法31-40
• 結(jié)果40-45
• 討論45-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-58
• 綜述58-68
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 作者簡歷68-70
• 致謝70-71
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集71

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4 張t，

本文編號：743895