本文關(guān)鍵詞：與H3K4me2相關(guān)的系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 組蛋白甲基化 染色質(zhì)免疫沉淀 核小體

【摘要】：目的 以H3組蛋白第4位賴氨酸二甲基化(dimethylation of histone H3 at lysine 4, H3K4me2)為分子靶標(biāo),采用染色質(zhì)免疫沉淀-高通量測(cè)序(chromatin immunoprecipitation deep sequencing, ChIP-seq)技術(shù),分析系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血單核細(xì)胞中可能的轉(zhuǎn)錄激活基因,探討其發(fā)病機(jī)制。方法1.收集臨床病例,采集外周靜脈血,采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法(Ficoll-hypaque density gradient centrifugation, Ficoll-Paque)分離單核細(xì)胞。2.核酶(Micrococcal nucleas, MNase)處理外周血單核細(xì)胞,并通過(guò)超聲物理剪切,使染色質(zhì)以單個(gè)或幾個(gè)核小體形式存在。3.以H3K4me2抗體,免疫沉淀經(jīng)MNase酶處理及超聲剪切后的染色質(zhì)；逆轉(zhuǎn)蛋白/DNA復(fù)合物的交聯(lián)結(jié)構(gòu),釋放DNA。4.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, real-time Q-PCR)證明染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)果是否可靠。5.采用ThruPLEXTM-FD Prep Kit構(gòu)建文庫(kù)。6.將建庫(kù)所得樣本進(jìn)行高通量測(cè)序分析及后續(xù)的生物信息學(xué)分析。結(jié)果SLE患者外周血單核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活的相關(guān)基因主要包括：鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent kinase, CaMK), CREMa(cAMP responsive element modulator (CREM) α subunit), IL-6、IL-10、IL-17細(xì)胞因子。結(jié)論H3K4me2分析提示的轉(zhuǎn)錄激活基因中CREMa轉(zhuǎn)錄因子激活是關(guān)鍵,其活性可由CaMK調(diào)控；CREMa轉(zhuǎn)錄因子激活,然后通過(guò)表觀遺傳調(diào)控機(jī)制可影響多個(gè)細(xì)胞因子表達(dá)及T細(xì)胞亞群形成。這表明CREMa在SLE患者異常的T淋巴細(xì)胞分子信號(hào)通路中有重要作用。
【關(guān)鍵詞】：系統(tǒng)性紅斑狼瘡 組蛋白甲基化 染色質(zhì)免疫沉淀 核小體
【學(xué)位授予單位】：浙江中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R593.241
【目錄】：

• 中文摘要5-6
• ABSTRACT6-8
• 前言8-10
• 第一部分 細(xì)胞處理實(shí)驗(yàn)10-24
• (一) 人外周血單核細(xì)胞的分離實(shí)驗(yàn)10-14
• 1. 材料與方法10-11
• 1.1. 儀器與試劑10
• 1.2. 實(shí)驗(yàn)方法10-11
• 2. 結(jié)果11-12
• 3. 分析與討論12-14
• (二) MNase酶處理細(xì)胞實(shí)驗(yàn)14-24
• 1. 材料與方法14-16
• 1.1. 儀器與試劑14
• 1.2. 實(shí)驗(yàn)方法14-16
• 2. 結(jié)果16-22
• 2.1. 細(xì)胞數(shù)量、MNase酶用量、超聲時(shí)間的確定16-20
• 2.2. 樣本的處理20-22
• 3. 分析與討論22-24
• 第二部分 染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)24-34
• (一) 染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)24-28
• 1. 材料與方法24-26
• 1.1. 儀器與試劑24
• 1.2. 實(shí)驗(yàn)方法24-26
• 2. 結(jié)果26
• 3. 分析與討論26-28
• (二) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)28-34
• 1. 材料與方法28-31
• 1.1. 儀器與試劑28
• 1.2. 實(shí)驗(yàn)方法28-31
• 2. 結(jié)果31-32
• 3. 分析與討論32-34
• 第三部分 高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建實(shí)驗(yàn)研究34-43
• (一) 文庫(kù)構(gòu)建實(shí)驗(yàn)34-37
• 1. 材料與方法34-36
• 1.1. 儀器與試劑34
• 1.2. 實(shí)驗(yàn)方法34-36
• 2. 結(jié)果36-37
• (二) Aglient 2100質(zhì)檢實(shí)驗(yàn)37-43
• 1. 材料與方法37-38
• 1.1. 儀器與試劑37
• 1.2. 實(shí)驗(yàn)方法37-38
• 2. 結(jié)果38-41
• 3. 分析與討論41-43
• 第四部分 健康對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-45
• 第五部分 高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析實(shí)驗(yàn)45-49
• 1. 實(shí)驗(yàn)方法45
• 2. 結(jié)果45-47
• 3. 分析與討論47-49
• 第六部分 全文小結(jié)49-50
• 第七部分 展望50-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 附圖55-56
• 致謝56-57
• 文獻(xiàn)綜述57-64
• 參考文獻(xiàn)60-64

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本文編號(hào)：697496