本文關鍵詞：β-羥丁酸抗硝基化干預糖尿病心臟微血管病變的機制

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【摘要】：目的:糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是由高血糖引起的慢性代謝性疾病,預計到2035年全球糖尿病患病人數將上升到5.9億。心臟微血管病變是糖尿病在心臟的特征性改變,其典型的病理變化是血管基底膜增厚致微循環(huán)障礙。糖尿病時,微血管內皮功能紊亂,可導致血管基底膜的主要成分發(fā)生改變,病理基礎是Ⅳ型膠原積聚,氧化應激引起的硝基化是核心病變。血管基底膜的主要成分Ⅳ型膠原的生成,主要受轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)通路的調控。TGF-β1通路主要經由Smad3激活Ⅳ型膠原基因轉錄。研究發(fā)現Smad3敲除,可使Ⅳ型膠原的α1鏈不表達。目前,糖尿病微血管基底膜增厚的內在機制尚未明確,且無特效的臨床治療手段,深入研究Ⅳ膠原的積聚的分子機制,可為糖尿病心臟微血管并發(fā)癥的有效防治提供治療新思路。酮體作為生物活性小分子,由β-羥丁酸(β-hydroxybutyrate,β-HB)(70%)、乙酰乙酸(30%)和丙酮(微量)組成,在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮多種保護功能。有報道研究,酮體的主要成分,β-HB可有效抑制氧化應激引起的細胞損傷,而心血管系統(tǒng)是其主要的作用部位。研究發(fā)現,不同于傳統(tǒng)的抗氧化劑,β-HB可參與調控基因表達。此外,β-HB還可作為Ⅰ類組蛋白脫乙�；�(Histone deacetylase,HDAC)的內源性和特異性的抑制劑,選擇性提高抗氧化保護性基因啟動子區(qū)的組蛋白乙酰化水平,起到抗氧化應激的作用。本實驗采用人心臟微血管內皮細胞(Human cardiac microvascular endothelial cells,HCMEC),首先應用不同濃度糖溶液培養(yǎng)HCMEC細胞,尋找模擬糖尿病高糖狀態(tài)的最佳濃度;不同濃度的β-HB高糖溶液培養(yǎng)HCMEC細胞,作用時間相同,確定β-HB的最佳作用濃度。采用實時定量聚合酶鏈式反應(Realtime-PCR,RT-PCR)檢測Ⅳ型膠原α1鏈(TypeⅣCollangenα1 chain,Ⅳα1)、誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)及基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase,MMP-9)m RNA水平變化,酶聯免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測細胞培養(yǎng)液中Ⅳ型膠原的含量。蛋白質印跡法(Western Blot)檢測細胞中P300、Smad3和HDAC3的硝基化水平變化;免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)技術,檢測Smad3分別與P300、HDAC3的結合;細胞免疫熒光檢測硝基酪氨酸(Nitrotyrosine,NT)含量。據此,探討β-HB抗硝基化,調控Ⅳ型膠原基因表達的分子機制,為治療提供實驗依據。方法:1細胞培養(yǎng):人心臟微血管內皮細胞HCMEC,購自美國模式菌種收集中心(ATCC)。HCMEC細胞用含5%胎牛血清的ECM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶消化傳代,接種于250 ml培養(yǎng)瓶中,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用β-HB、3-嗎啉-斯德酮亞胺(3-morpholinosydnonimine,SIN-1)及四磺基苯基鐵卟啉(5,10,15,20-Tetrakis-(4-sulfonatophenyl)porphyrinato-iron(Ⅲ),Fe TPPs)處理HCMEC細胞,SIN-1組應用低糖ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)+SIN-1,β-HB及Fe TPPs組分別應用高糖ECM培養(yǎng)+β-HB及Fe TPPs培養(yǎng)。2細胞實驗設計與分組:2.1探討不同糖濃度ECM對HCMEC細胞中Ⅳα1、MMP-9、i NOS基因表達影響用不同糖濃度ECM培養(yǎng)HCMEC細胞24 h,根據不同糖濃度的ECM分為5組:Con組(正常對照,細胞用低糖-ECM培養(yǎng))、20 m M組(細胞用含20 m M的葡萄糖-ECM培養(yǎng))、25 m M組(細胞用含25 m M的葡萄糖-ECM培養(yǎng))、30 m M組(細胞用含30 m M的葡萄糖-ECM培養(yǎng))及35 m M組(細胞用含35 m M的葡萄糖-ECM培養(yǎng))。2.2探討不同濃度的β-HB對HCMEC細胞中Ⅳα1、MMP-9和i ONS m RNA表達的影響根據β-HB濃度不同分為5組:Con組(正常對照,細胞用低糖-ECM培養(yǎng))、高糖組(細胞用含30 m M的葡萄糖-ECM培養(yǎng))、β-HB2組(0.02m Mβ-HB+30 m M高糖組)、β-HB4組(0.04 m Mβ-HB+30 m M高糖組)和β-HB6組(0.06 m Mβ-HB+30 m M高糖組)。2.3 HCMEC細胞中Ⅳα1 m RNA表達水平的檢測Trizol一步法分別提取HCMEC細胞中總RNA;用β-actin做內參,RT-PCR方法檢測Ⅳα1 m RNA表達。2.4 ELSIA檢測細胞培養(yǎng)液中Ⅳ型膠原蛋白含量;Western blot檢測HCMEC細胞中P300、Smad3、HDAC3及NT蛋白含量;Co-IP檢測HCMEC細胞中Smad3與P300、HDAC3的結合活性實驗分成5組:Con組(正常對照,細胞用低糖-ECM培養(yǎng))、高糖組(細胞用含30 m M的葡萄糖-ECM培養(yǎng))、SIN-1組(細胞用低糖-ECM+5 m M SIN-1培養(yǎng))、β-HB組(細胞用含30 m M的葡萄糖-ECM+0.04 m Mβ-HB培養(yǎng))、Fe TPPs組(細胞用含30 m M的葡萄糖ECM+5 m M Fe TPPs培養(yǎng))。2.5利用免疫熒光法,檢測HCMEC細胞中NT含量變化2.6統(tǒng)計學處理所有實驗均重復三次,數據采用均數±標準差(X?S)表示,采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學處理分析,對所測定數據分析均采用One-Way-ANOVA法進行單因素方差分析,P0.05為差異有統(tǒng)計學顯著意義。結果:1 RT-PCR檢測不同糖濃度ECM對HCMEC中Ⅳα1、MMP-9和i NOS m RNA表達Ⅳα1 m RNA的相對表達量與Con組比20 m M組(2.56±0.06,P0.05)、25 m M組(2.43±0.18,P0.05)、30 m M組(4.97±0.46,P0.01)及35 m M組(2.41±0.17,P0.05)均明顯升高。MMP-9 m RNA的相對表達量與Con組比20 m M組(0.16±0.03,P0.05)、25 m M組(0.09±0.04,P0.05)、30 m M組(0.02±0.01,P0.01)及35 m M組(0.05±0.02,P0.05)均明顯降低。i NOS m RNA的相對表達量與Con組比20 m M組(1.30±0.19,P0.05)、25 m M組(2.12±0.03,P0.05)、30 m M組(3.05±0.05,P0.01)及35 m M組(2.07±0.02,P0.05)均升高。2 RT-PCR檢測不同濃度β-HB對HCMEC細胞中Ⅳα1、MMP-9和i NOS m RNA表達的影響Ⅳα1 m RNA的相對表達量與HG組比β2組(0.27±0.02,P0.05)、β4組(0.15±0.01,P0.01)及β6組(0.32±0.02,P0.05)均降低。MMP-9 m RNA的相對表達量與HG組比β2組(1.10±0.01,P0.05)、β4組(1.73±0.03,P0.01)及β6組(1.01±0.01,P0.05)均升高。i NOS m RNA的相對表達量與HG組比β2組(0.56±0.03,P0.05)、β4組(0.15±0.01,P0.01)及β6組(0.38±0.02,P0.05)均降低。3 RT-PCR檢測HCMEC細胞中Ⅳα1 m RNA表達的影響。與Con組比HG組(2.17±0.11,P0.05)及SIN-1組(1.94±0.08,P0.05)升高;與HG組比較β-HB組(1.21±0.10,P0.05)及Fe TPPs組(0.93±0.08,P0.01)均降低。4 ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中Ⅳ型膠原蛋白含量。與Con組比較HG組(6.58±0.04 pg/m L,P0.05)、SIN-1組(4.57±0.07 pg/m L,P0.05)Ⅳ型膠原蛋白含量明顯升高,均有統(tǒng)計學差異;而β-HB組(3.21±0.12 pg/m L,P0.05)及Fe TPPs組(3.33±0.01 pg/m L,P0.05)Ⅳ型膠原蛋白含量與Con組比較無統(tǒng)計學差異。5 Western blot法檢測各組HCMEC細胞中P300、Smad3、HDAC3及NT蛋白含量。P300蛋白相對表達量與Con組比HG組(0.42±0.02,P0.01)及SIN-1組(0.29±0.01,P0.05)升高;與HG組比較β-HB組(0.17±0.01,P0.01)及Fe TPPs組(0.15±0.01,P0.05)均降低。Smad3蛋白相對表達量與Con組比HG組(0.96±0.01,P0.01)及SIN-1組(0.85±0.03,P0.05)升高;與HG組比較β-HB組(0.46±0.02,P0.01)及Fe TPPs組(0.82±0.01,P0.05)均降低。HDAC3蛋白相對表達量與Con組比HG組(2.17±0.11,P0.01)及SIN-1組(1.94±0.08,P0.01)升高;與HG組比較β-HB組(1.21±0.10,P0.01)及Fe TPPs組(0.93±0.08,P0.01)均降。NT蛋白相對表達量與Con組比HG組(0.42±0.02,P0.01)及SIN-1組(0.39±0.02,P0.05)升高;與HG組比較β-HB組(0.17±0.02,P0.01)及Fe TPPs組(0.15±0.01,P0.05)均降低。6 Co-IP技術檢測各組HCMEC細胞中Smad3與P300、HDAC3的結合活性6.1 Smad3與P300結合活性檢測Con組、HG組、SIN-1組、β-HB組及Fe TPPs組細胞蛋白裂解液分別加入Smad3抗體沉淀處理后,Western blot結果分析顯示與Con組比較,HG組Smad3與P300蛋白結合量(4.79±0.27,P0.01)明顯高于Con組(1.40±0.17);β-HB組及Fe TPPs組Smad3與P300蛋白結合量分別為(2.06±0.31,P0.01)與(2.98±0.03,P0.05),與HG組比較明顯降低。Con組、HG組、SIN-1組、β-HB組及Fe TPPs組細胞蛋白裂解液分別加入P300抗體沉淀處理后,Western blot結果分析顯示:HG組及SIN-1組P300與Smad3蛋白結合量(5.24±0.18,P0.01)與Con組(1.23±0.07)比較,明顯升高;而β-HB組及Fe TPPs組P300與Smad3蛋白結合量為(2.11±0.26,P0.01)與(3.46±0.10,P0.05)低于HG組。6.2 Smad3與HDAC3結合活性檢測Con組、HG組、SIN-1組、β-HB組及Fe TPPs組細胞蛋白裂解液分別加入Smad3抗體沉淀處理后,Western blot結果分析顯示:與Con組比較,HG組Smad3與HDAC3蛋白結合量(3.47±0.18,P0.05)明顯高于Con組(1.21±0.11);β-HB組及Fe TPPs組Smad3與HDAC3蛋白結合量為(1.72±0.17,P0.01)和(2.39±0.19,P0.05),與HG組比較明顯降低。Con組、HG組、SIN-1組、β-HB組及Fe TPPs組細胞蛋白裂解液分別加入HDAC3抗體沉淀處理后,Western blot結果分析顯示:HG組及SIN-1組HDAC3與Smad3蛋白結合量(4.15±0.25,P0.01)與Con組(1.28±0.14)比較,明顯升高;而β-HB組及Fe TPPs組HDAC3與Smad3蛋白結合量為(1.87±0.10,P0.01)和(2.03±0.23,P0.05)低于HG組。7免疫熒光法檢測HCMEC細胞中NT含量。與Con組比較HG組及SIN-1組NT熒光強度均明顯增強,以HG組最為顯著;而β-HB組及Fe TPPs組NT熒光強度與HG組比較明顯減弱。結論:1β-HB可明顯抑制高糖(30 m M)引起的HCMEC細胞中Ⅳ型膠原α1鏈表達,其抑制強度以0.04 m Mβ-HB濃度最為顯著。2β-HB能夠抑制高糖(30 m M)引起的HCMEC細胞中P300、Smad3、HDAC3及NT蛋白表達。3β-HB能夠抑制高糖(30 m M)引起的HCMEC細胞中Smad3與P300及HDAC3之間相互作用。
【關鍵詞】：β-羥丁酸 人心臟微血管內皮細胞 硝基化 Ⅳ型膠原 糖尿病心臟微血管病變
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2
【目錄】：

• 中文摘要4-10
• 英文摘要10-17
• 英文縮寫17-18
• 前言18-20
• 材料與方法20-31
• 結果31-33
• 附圖33-41
• 討論41-45
• 結論45-46
• 參考文獻46-50
• 綜述 糖尿病心臟微血管病變機制50-61
• 參考文獻56-61
• 致謝61-62
• 個人簡歷62

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前2條

1 Mark T Waddingham;Amanda J Edgley;Hirotsugu Tsuchimochi;Darren J Kelly;Mikiyasu Shirai;James T Pearson;;Contractile apparatus dysfunction early in the pathophysiology of diabetic cardiomyopathy[J];World Journal of Diabetes;2015年07期

2 Marcello C Bertoluci;Gislaine V Cé;Antnio MV da Silva;Marco V Wainstein;Winston Boff;Marcia Puales;;Endothelial dysfunction as a predictor of cardiovascular disease in type 1 diabetes[J];World Journal of Diabetes;2015年05期

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本文編號：687637