本文關(guān)鍵詞：酪氨酸磷酸酶Shp2在小鼠樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的過敏性哮喘中的作用研究

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【摘要】：哮喘是一種慢性小氣道炎癥疾病,屬于I型超敏反應(yīng)。哮喘的主要病理特征包括氣道高反應(yīng)性,以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤為主的炎癥、杯狀細(xì)胞化生及黏液過度分泌等。目前缺乏安全治愈哮喘的有效藥物,解析哮喘的發(fā)病機制及其調(diào)控過程對于哮喘新型診療方案制定具有重要意義。樹突狀細(xì)胞(DC)是功能最強的抗原遞呈細(xì)胞,被視為連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。當(dāng)外界抗原進(jìn)入氣道時,首先由DC識別并將抗原吞噬加工處理,在加工處理的同時也會向附近的淋巴結(jié)遷移,DC在遷移的過程中不斷成熟,在淋巴結(jié)中促使Naive T細(xì)胞分化為Th2型細(xì)胞,Th2型細(xì)胞進(jìn)一步激活B細(xì)胞使其產(chǎn)生大量IgE抗體吸附于肥大細(xì)胞表面,當(dāng)外界相同的抗原再次入侵機體,抗原與IgE抗體結(jié)合,引起肥大細(xì)胞活化,分泌大量活性介質(zhì),導(dǎo)致氣道痙攣和氣道炎癥。蛋白磷酸酶與激酶介導(dǎo)的可逆磷酸化調(diào)控是細(xì)胞信號傳遞中最廣泛、最普遍的調(diào)控方式。Shp2由PTPl1 基因編碼,是一種廣泛表達(dá)的非受體型酪氨酸磷酸酶,參與了炎癥反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生和免疫調(diào)節(jié)等許多重要的病理生理過程。而對于哮喘的關(guān)鍵起始過程的調(diào)控并無報道。前期研究發(fā)現(xiàn)Shp2可以參與肺上皮損傷及肺部炎癥調(diào)控,這提示了Shp2在調(diào)控肺部損傷中的重要作用。目前關(guān)于Shp2對過敏性哮喘影響的研究主要集中在炎癥發(fā)生的后期,包括維持IL-5誘導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞的存活以及正向調(diào)控氣道上皮細(xì)胞TGF-β的產(chǎn)生從而影響哮喘后期的氣道重構(gòu)。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)Shp2通過C型凝集素受體通路介導(dǎo)了DC抵抗白色念珠菌感染的過程。這提示我們Shp2在DC介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中具有重要作用。本項研究中,我們首先構(gòu)建了DC特異性敲除Shp2的小鼠(Cdl 1c-CreShp2Flox/Flox)在無外界壓力情況下敲除組小鼠與對照組在肺組織結(jié)構(gòu)、白細(xì)胞分類計數(shù)等方面沒有明顯差異。其次我們利用HDM及OVA分別誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生過敏性哮喘,結(jié)果顯示DC中缺失Shp2可以緩解由過敏原引起的哮喘。在哮喘的發(fā)病進(jìn)程中,DC的吞噬、成熟、遷移以及抗原遞呈都起到了非常重要的作用,因此我們對DC的各項功能分別做了檢測。我們用OVA偶聯(lián)Alexa-Flour 647的熒光染料與小鼠骨髓誘導(dǎo)分化的DC共孵育檢測其對抗原的吞噬能力,結(jié)果顯示Shp2缺失并不影響DC的吞噬。接著,我們對DC表面標(biāo)記Cdllc以及與其成熟相關(guān)的共刺激分子CD80、CD86進(jìn)行流式檢測。檢測發(fā)現(xiàn)Shp2缺失對于DC共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)量沒有影響。下一步我們利用Transwell小室對DC的遷移進(jìn)行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Shp2缺失可以明顯抑制DC遷移。最后我們對DC骨架染色發(fā)現(xiàn)敲除Shp2可影響DC骨架重排�；谝陨蠈嶒灲Y(jié)果我們發(fā)現(xiàn)Shp2主要通過影響DC遷移進(jìn)而影響哮喘的發(fā)病過程。該研究可以幫助更好地理解過敏性哮喘的病理過程,并為該疾病的診斷治療提供新的治療靶點。
【關(guān)鍵詞】：Shp2 HDM OVA 過敏性哮喘 樹突狀細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R562.25
【目錄】：

• 致謝4-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 英文縮略詞表11-16
• 1 引言16-20
• 2. 材料和試劑20-27
• 2.1 主要儀器20-21
• 2.2 主要試劑耗材21-22
• 2.3 小鼠22-23
• 2.4 細(xì)胞23
• 2.5 試劑配制23-27
• 2.5.1 LPS儲存液23
• 2.5.2 HDM儲存液23
• 2.5.3 福爾馬林23
• 2.5.4 麻醉劑23
• 2.5.5 PBS配置23-24
• 2.5.6 核酸電泳緩沖液24
• 2.5.7 DNA Loading Buffer24
• 2.5.8 EDTA24-25
• 2.5.9 Tris Buffer25
• 2.5.10 Tris Buffer25
• 2.5.11 蛋白Running Buffer25
• 2.5.12 蛋白Trans Buffer25
• 2.5.13 Protein Loading Buffer25-26
• 2.5.14 白細(xì)胞計數(shù)液配置26-27
• 3. 實驗方法27-37
• 3.1 小鼠基因型鑒定27-28
• 3.1.1 引物設(shè)計27
• 3.1.2 PCR反應(yīng)體系27
• 3.1.3 PCR條件27-28
• 3.2 小鼠哮喘模型的建立及肺泡灌洗液處理28-29
• 3.2.1 HDM造模方法28-29
• 3.2.2 OVA造模方法29
• 3.3 肺組織切片和HE染色29-30
• 3.4 PAS染色30
• 3.5 免疫組化30-31
• 3.6 細(xì)胞免疫熒光31-32
• 3.7 細(xì)胞RNA提取及熒光定量PCR32
• 3.8 蛋白制樣32-33
• 3.9 免疫印跡33-35
• 3.9.1 清洗玻璃板33
• 3.9.2 灌膠與上樣33-34
• 3.9.3 電泳34
• 3.9.4 轉(zhuǎn)膜34
• 3.9.5 免疫反應(yīng)34-35
• 3.10 DC純化35
• 3.11 DC抗原吞噬實驗35-36
• 3.12 DC成熟實驗36
• 3.13 體外DC遷移實驗(Transwell實驗)36-37
• 4. 實驗結(jié)果37-50
• 4.1 構(gòu)建樹突狀細(xì)胞特異性敲除Shp2的小鼠品系37-40
• 4.2 樹突狀細(xì)胞特異性敲除Shp2緩解HDM誘導(dǎo)的過敏性哮喘40-44
• 4.3 樹突狀細(xì)胞特異性敲除Shp2緩解OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘44-46
• 4.4 Shp2特異性缺失對樹突狀細(xì)胞的吞噬、成熟的影響46-48
• 4.5 Shp2缺失調(diào)控樹突狀細(xì)胞的遷移能力48-50
• 5. 討論50-52
• 6. 結(jié)論52-53
• 附錄53-55
• 參考文獻(xiàn)55-57
• 靶向蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2的抑制劑研究進(jìn)展57-73
• 參考文獻(xiàn)68-73
• 作者簡歷及在讀期間取得的科研成果73

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 趙迎春;張前軍;盧永仲;陳海燕;;小分子蛋白酪氨酸激酶抑制劑的合成研究進(jìn)展[J];化學(xué)研究;2014年04期

2 吳狄;鄧祥;王坤;黃小梅;;蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)及其抑制劑的研究進(jìn)展[J];廣州化工;2012年09期

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本文編號：604790