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短肽FLPNF增強自噬對INS-1細胞hIAPP聚集的影響及其分子機制的實驗研究

發(fā)布時間:2024-07-08 23:04
  目的:糖尿病是嚴重威脅人類健康的重大慢性疾病之一。根據(jù)最新報道,我國成年人糖尿病的患病率為10.9%,是世界上糖尿病病人最多的國家。在所有糖尿病病人中,2型糖尿病約占90-95%。盡管在過去的20年中,國內(nèi)外學者對2型糖尿病進行了大量的研究工作,但其具體的病理生理機制仍不十分清楚。目前認為其發(fā)生發(fā)展因素可分為以下三類:(1)遺傳易感因素;(2)胰島淀粉樣多肽(islet amyloid polypeptide,IAPP)所致的細胞毒性;(3)與生活和飲食方式相關的風險因素等。2型糖尿病病人以胰島β細胞功能障礙和數(shù)量顯著減少、胰島素抵抗及胰島淀粉樣蛋白沉積形成為主要病理生理學特征。其中,人胰島淀粉樣多肽(human islet amyloid polypeptide,hIAPP)是胰島淀粉樣蛋白沉積的主要成分。越來越多的研究表明,hIAPP誘導的胰島β細胞功能障礙和細胞凋亡增加在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。因此,預防和減少hIAPP沉積可減少胰島β細胞凋亡、改善胰島β細胞的胰島素分泌功能。自噬-溶酶體系統(tǒng)是細胞降解錯誤折疊蛋白和受損細胞器的主要途徑之一。目前研究認為自噬-溶酶體系...

【文章頁數(shù)】:113 頁

【學位級別】:博士

【文章目錄】:
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分 :短肽FLPNF增強hIAPP-INS-1 細胞自噬流的實驗研究
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 材料與試劑
            2.1.1 細胞
            2.1.2 主要試劑與耗材
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養(yǎng)
            2.2.2 短肽的合成與準備
            2.2.3 Western Blot檢測TAT-FLPNF、FLPNF對 INS-1 細胞LC3 表達的影響
            2.2.4 CCK-8 檢測TAT-FLPNF對 INS-1 細胞活力的影響
            2.2.4 過表達hIAPP的 hIAPP-INS-1 細胞的構建
            2.2.6 Western Blot檢測不同濃度TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細胞LC3 表達的影響
            2.2.7 Western Blot檢測TAT-FLPNF對hIAPP-INS-1 細胞LC3、P62 表達的影響
            2.2.8 透射電子顯微鏡檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細胞自噬體數(shù)量的影響
            2.2.9 表達m RFP-GFP-LC3的hIAPP-INS-1 細胞的構建
            2.2.10 激光共聚焦顯微鏡檢測hIAPP-INS-1 細胞內(nèi)自噬流情況
            2.2.11 統(tǒng)計學分析
    3 結果
        3.1 短肽TAT-FLPNF可進一步增加INS-1 細胞LC3-II/LC3-I比值
        3.2 短肽TAT-FLPNF不影響INS-1 細胞活力
        3.3 短肽TAT-FLPNF增加細胞LC3-II/LC3-I比值的最佳濃度為200μM
        3.4 短肽TAT-FLPNF增加LC3-II/LC3-I比值可被自噬抑制劑3-MA阻斷
        3.5 短肽TAT-FLPNF顯著增加細胞自噬體數(shù)量
        3.6 短肽TAT-FLPNF促進細胞自噬體的形成
        3.7 短肽TAT-FLPNF增強細胞自噬流
    4 討論
    5 結論
第二部分 :短肽FLPNF增強hIAPP-INS-1 細胞自噬流的分子機制研究
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1
            2.1.1 細胞
            2.1.2 主要試劑與耗材
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養(yǎng)
            2.2.2 短肽的合成與準備
            2.2.3 過表達hIAPP的 hIAPP-INS-1 細胞的構建
            2.2.4 表達myr-Akt的 HEK-293-myr-Akt細胞的構建
            2.2.5 過表達Flag-labeled mTOR的 HEK-293 細胞的構建
            2.2.6 Western Blot檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細胞p70S6K及 S6 磷酸化水平的影響
            2.2.7 Western Blot檢測TAT-FLPNF對 HEK-293-myr-Akt細胞GSK3β及S6磷酸化水平的影響
            2.2.8 Western Blot檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細胞Akt、p70S6K及S6磷酸化水平的影響
            2.2.9 流式細胞儀檢測Anti-Flag免疫磁珠上的FITC信號強度
            2.2.10 Autodock Vina軟件預測短肽FLPNF與 FRB結構域的結合情況
            2.2.11 統(tǒng)計學分析
    3 結果
        3.1 短肽TAT-FLPNF抑制PI3K-Akt-mTOR-p70S6K信號通路
        3.2 短肽TAT-FLPNF抑制mTOR活性
        3.3 短肽TAT-FLPNF抑制mTORC1 活性,但不影響mTORC2 活性
        3.4 短肽FLPNF與 FRB結構域結合
    4 討論
    5 結論
第三部分 :短肽FLPNF減少hIAPP寡聚體沉積、保護hIAPP-INS-1 細胞的實驗研究
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1
            2.1.1 細胞
            2.1.2 主要試劑與耗材
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細胞培養(yǎng)
            2.2.2 短肽的合成與準備
            2.2.3 過表達hIAPP的 hIAPP-INS-1 細胞的構建
            2.2.4 過表達r IAPP的 r IAPP-INS-1 細胞的構建
            2.2.5 寡聚體抗體A11 檢測短肽TAT-FLPNF對 hIAPP寡聚體沉積的影響
            2.2.6 CCK-8 檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細胞活力的影響
            2.2.7 Western Blot檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1細胞CleavedCaspase-3 表達的影響
            2.2.8 ELISA檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細胞GSIS功能的影響
            2.2.9 統(tǒng)計學分析
    3 結果
        3.1 短肽TAT-FLPNF減少hIAPP-INS-1 細胞內(nèi)hIAPP寡聚體沉積
        3.2 短肽TAT-FLPNF提高hIAPP-INS-1 細胞活力
        3.3 短肽TAT-FLPNF降低hIAPP-INS-1 細胞Cleaved Caspase-3 水平
        3.4 短肽TAT-FLPNF改善hIAPP-INS-1 細胞葡萄糖刺激胰島素分泌能力
    4 討論
    5 結論
本研究創(chuàng)新性的自我評價
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝
個人簡歷



本文編號:4004010

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