研究背景與目的:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜增生為特征的慢性自身免疫性疾病。病理特征為炎癥細胞浸潤、滑膜組織增生以及血管翳的形成,進而導(dǎo)致軟骨及骨質(zhì)破壞,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙。RA成纖維樣滑膜細胞(Rheumatoid arthritis Fibroblast-like synoviocyte,RA-FLS)是滑膜組織的主要成分,在炎性因子的刺激下,RA-FLS異常活化,具有異常的遷移、侵襲等一些類似于腫瘤細胞樣的特性。在關(guān)節(jié)軟骨和骨侵蝕中發(fā)揮關(guān)鍵作用�；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases,TIMPs)是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的天然抑制劑。TIMP3是TIMPs家族中唯一幾乎能抑制全部MMPs的抑制劑。小分子非編碼RNA已成為包括自身免疫性疾病在內(nèi)的多種疾病的可能生物標志物,參與細胞增殖、凋亡、分化、血管生成和免疫應(yīng)答等過程的調(diào)控。miR-206屬于MyomiRs家族,近年來研究表明,miR-206能調(diào)控腫瘤細胞的遷移...

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【學(xué)位級別】：碩士

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摘要
Abstract
中英文縮略詞對照表
前言
1. 主要實驗材料
    1.1 試劑耗材
    1.2 實驗儀器及設(shè)備
    1.3 常用配方
2. 主要實驗方法
    2.1 細胞培養(yǎng)技術(shù)
        2.1.1 原代RA-FLS的制備與培養(yǎng)
        2.1.2 細胞培養(yǎng)
        2.1.3 細胞鑒定
        2.1.4 細胞凍存
        2.1.5 細胞復(fù)蘇
    2.2 腺病毒感染細胞
    2.3 慢病毒的構(gòu)建
        2.3.1 轉(zhuǎn)化
        2.3.2 挑克隆、搖菌
        2.3.3 質(zhì)粒的提取
        2.3.4 質(zhì)粒的電泳
        2.3.5 慢病毒包裝實驗
    2.4 慢病毒感染細胞
    2.5 RT-qPCR
        2.5.1 總RNA提取(全程冰上操作)
        2.5.2 反轉(zhuǎn)錄
        2.5.3 qPCR檢測TIMP3的mRNA水平
        2.5.4 加尾反轉(zhuǎn)錄
        2.5.5 miRNA的qPCR檢測
    2.6 Western Blot實驗
        2.6.1 總蛋白提取(冰上操作)
        2.6.2 蛋白定量
        2.6.3 SDS-PAGE電泳
    2.7 細胞劃痕實驗
    2.8 Transwell細胞遷移實驗
    2.9 Transwell侵襲實驗
    2.10 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?br>        2.10.1 psiCHECK-2-TIMP3'UTR-WT質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.10.2 重組質(zhì)粒psi-check-2/TIMP3 3'UTR突變型質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.10.3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?br>    2.11 統(tǒng)計學(xué)處理
3 實驗結(jié)果
    3.1 MH7A細胞及RA-FLS細胞的鑒定結(jié)果
    3.2 TIMP3對RA-FLS遷移與侵襲的影響
        3.2.1 構(gòu)建過表達TIMP3的RA-FLS細胞模型
        3.2.2 過表達TIMP3抑制RA-FLS的遷移及侵襲
    3.3 miR-206對RA-FLS遷移與侵襲的影響
        3.3.1 構(gòu)建過表達miR-206的RA-FLS細胞模型
        3.3.2 過表達miR-206促進RA-FLS遷移與侵襲
        3.3.3 構(gòu)建抑制表達miR-206的RA-FLS細胞模型
        3.3.4 抑制miR-206的表達能抑制RA-FLS遷移及侵襲
    3.4 miR-206負調(diào)控RA-FLS中TIMP3的表達
    3.5 miR-206靶向調(diào)控TIMP3
        3.5.1 psiCHECK-2 TIMP3 3'UTR-WT重組載體構(gòu)建成功
        3.5.2 psiCHECK-2/TIMP3突變型質(zhì)粒構(gòu)建成功
        3.5.3 TIMP3是miR-206直接調(diào)控的靶基因
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻
文獻綜述
    參考文獻
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文及獲得的獎勵



本文編號：3992587