發(fā)布時間：2021-12-23 03:51

　　目的:本研究通過基因芯片技術(shù)探討廣州市花都區(qū)2型糖尿病外周血中circRNA的差異表達(dá)譜特征,并在人群中進(jìn)一步驗證circRNA表達(dá)水平與2型糖尿病發(fā)病之間的關(guān)聯(lián);通過分析表達(dá)差異的circRNA以及生化指標(biāo)與2型糖尿病之間的相關(guān)性,探討表達(dá)差異的circRNA作為2型糖尿病生物標(biāo)志物的可能性;最后預(yù)測差異表達(dá)circRNA在2型糖尿病發(fā)病過程中的功能機(jī)制,為2型糖尿病的預(yù)防治療提供依據(jù)。方法:本研究依據(jù)2019年1月至10月份廣州市花都區(qū)18周歲以上居民的現(xiàn)場調(diào)查。采用個體匹配的病例對照研究設(shè)計,共納入了107名2型糖尿病患者與以性別相同,年齡差±5歲為匹配條件篩選的107名健康參照者為研究對象。第一階段收集4名2型糖尿病患者與4名健康參照組的外周血,通過circRNA基因芯片技術(shù)篩選兩組間circRNA差異表達(dá)譜。第二階段收集103名2型糖尿病與103名健康參照者的全血樣本以及人口學(xué)、實驗室檢查等信息。circRNA差異表達(dá)譜中篩選的4個circRNA通過實時熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行定量檢測,采用受試者工作曲線（ROC曲線）評價目標(biāo)circRNA在2型糖尿病中的診斷價值,采用多因素條... 

【文章來源】：廣東藥科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

研究樣本流程圖

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文13（4）芯片掃描與結(jié)果分析：對玻片清洗、固定后使用AgilentScannerG2505C進(jìn)行掃描，掃描后的圖像通過軟件AgilentFeatureExtraction11.0.1.1中獲得熒光信號等原始數(shù)據(jù)，再使用R軟件歸一化處理，通過使用R軟件ggplot2包繪制火山圖，分析病例組與對照組在circRNA表達(dá)水平上的一致性，病例組與對照組表達(dá)差異的circRNA通過變化倍數(shù)與P值進(jìn)行篩選，選取變化倍數(shù)（foldchangeFC）不低于1.5倍即|FC|≥1.5，t檢驗以P<0.05作為陽性結(jié)果。circRNA芯片實驗由上海康成生物有限公司協(xié)助完成。2.6實時熒光定量PCR反應(yīng)（qPCR）法驗證差異表達(dá)的circRNA2.6.1實時熒光定量PCR檢測circRNA的原理實時熒光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR,qPCR）是一種在模板DNA發(fā)生指數(shù)型擴(kuò)增的反應(yīng)中，通過熒光染料或者化合物等材料測定每次循環(huán)后目標(biāo)產(chǎn)物總量的方法，根據(jù)熒光化合物的不同，可以分為TaqMan熒光探針方法與SYBRGreenⅠ染料試劑法進(jìn)行檢測。本實驗中使用SYBRGreenⅠ染料試劑法，該方法是在擴(kuò)增反應(yīng)體系中引入了過量的SYBR熒光染料劑，這些染料能特異性地結(jié)合到DNA雙鏈后產(chǎn)生熒光信號，而沒有結(jié)合到DNA雙鏈的SYBR熒光染料不會產(chǎn)生熒光信號，通過分析每個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號強(qiáng)度、閾值（Ct）和溶解曲線，可對目的基因相對表達(dá)量進(jìn)行測定。圖2-2實時熒光定量PCR檢測circRNA的原理示意圖

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文22表3-2RNA定量與質(zhì)量檢測結(jié)果SampleIDA260/280A260/230Conc(ng/ul)Volume(ul)Quantity(ng)QCresult(passorfail)T2DM11.941.81548.65158229.75passT2DM21.891.80259.05153885.75passT2DM32.002.27238.34153575.1passT2DM42.092.23270.13154051.95passNGT11.901.90261.88153928.20passNGT21.872.06270.69154060.35passNGT31.982.24156.02152340.34passNGT42.002.30249.79153746.81pass注：T2DM1、T2DM2、T2DM3、T2DM4為糖尿病組，NGT1、NGT2、NGT3、NGT4分別為配對的對照組圖3-1RNA瓊脂糖凝膠電泳（左圖為糖尿病組，右圖為對照組）3.1.3火山圖與散點圖circRNA芯片數(shù)據(jù)結(jié)果經(jīng)過歸一化處理后，使用散點圖能反應(yīng)糖尿病組與對照組中circRNA的總體分布趨勢，同時可以評估兩組樣本中circRNA表達(dá)的差異性。以對照組的circRNA平均表達(dá)量進(jìn)行l(wèi)og2對數(shù)轉(zhuǎn)換的信號值為橫坐標(biāo)，以糖尿病組的circRNA平均表達(dá)量進(jìn)行l(wèi)og2對數(shù)轉(zhuǎn)換的信號值為縱坐標(biāo)建立散點圖（圖3-2），圖中在line1綠色線上方與line2綠色線下方為變化倍數(shù)|FC|≥1.5，P<0.05的顯著表達(dá)差異circRNA，其中l(wèi)ine1線上方為表達(dá)上調(diào)的circRNA，line2線下方為表達(dá)下調(diào)的circRNA。火山圖能將circRNA芯片結(jié)果中基因的數(shù)量、差異的顯著性與可靠性進(jìn)行可視化，本實驗中根據(jù)變化倍數(shù)FC與P值作圖，以橫坐標(biāo)為log2(FC)，縱坐標(biāo)為-log10(P值)建立火山圖（圖3-3），圖中水平綠色線以上與兩條豎直綠色線以外的


本文編號：3547723