第一部分遺傳性凝血因子Ⅴ/Ⅷ聯(lián)合缺乏癥的分子機(jī)制研究目的:凝血因子V/Ⅷ聯(lián)合缺乏癥（F5F8D）是一種罕見的出血性疾病,大多數(shù)患者有自發(fā)出血癥狀。本研究旨在對(duì)一例中國F5F8D家系進(jìn)行基因檢測,探討其分子發(fā)病機(jī)制。方法:先證者為一名30歲女性,自述有月經(jīng)過多和皮膚易青紫的癥狀,父母近親結(jié)婚并無異常出血傾向。對(duì)患者及其父、母進(jìn)行血常規(guī)、凝血四項(xiàng)、混合血漿糾正的APTT試驗(yàn)、內(nèi)外源凝血因子活性及血漿vWF:Ag檢測。根據(jù)檢查結(jié)果,應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增先證者FV基因（F5）或FⅧ基因（F8）、LMAN1及MCFD2基因的所有外顯子和側(cè)翼序列,并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測序。測序結(jié)果應(yīng)用Chromas軟件與正常序列進(jìn)行比對(duì),根據(jù)先證者基因突變位點(diǎn)擴(kuò)增其父、母相關(guān)基因位點(diǎn)并測序。應(yīng)用Clustal-X2.1軟件分析突變位點(diǎn)的保守性,Polyphen2、SIFT、Mutation Teasers、PyMOL軟件分析突變結(jié)果對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的影響。結(jié)果:先證者的FV:C、FⅧ:C、PT、APTT和vWF:Ag分別為9.9%、5.9%、17s、75s和101.0%,混合血漿糾正試驗(yàn)示PT、APTT... 

【文章來源】：南京大學(xué)江蘇省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．?ＭＣＦＤ２基因４號(hào)外顯子基因序列，Ａ為先證者，Ｂ為其父親，Ｃ為其母親，??黑色箭頭所指部位為突變位點(diǎn)，先證者發(fā)生ＭＣＦＤ２基因純合錯(cuò)義突變ｇ．?３９８Ａ＞Ｔ??

其父親在該位點(diǎn)的基因型正常，??如圖２．先證者家族遺傳圖譜見圖３．。??Ｓ．３９ＳＡ＞Ｔ??？?＊?ｉ?＊?？?？?■?？?？？？？＊？?？?？?？＿？？？？？??Ａ??Ｂ??ＩＭＴｕｄｄＡｌＭｈｉｌＭｌＭｆ??ｙｋｌｗＵｌｌｉｋｉｊｉＭ??圖１．?ＭＣＦＤ２基因４號(hào)外顯子基因序列，Ａ為先證者，Ｂ為其父親，Ｃ為其母親，??黑色箭頭所指部位為突變位點(diǎn)，先證者發(fā)生ＭＣＦＤ２基因純合錯(cuò)義突變ｇ．?３９８Ａ＞Ｔ??（Ｐ．Ｄ１３３Ｖ），３９８位堿基Ａ被Ｔ取代，引起１３３位氨基酸天冬氨酸被纈氨酸取??代，其父母該基因雜合突變。??第８頁??

運(yùn)用Ｃｌｕｓｔａｌ－Ｘ?２．?１軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)，結(jié)果顯示ＭＣＦＤ２第４號(hào)外顯子??的１３３位氨基酸Ａｓｐ高度保守，而ＦＶＤＩ基因１４號(hào)外顯子１６７１位氨基酸Ａｒｇ不是??高度保守序列，見圖４．。ＰｏｌｙＰｈｅｎ－２軟件分析Ａｓｐｌ３３Ｖａｌ對(duì)蛋白質(zhì)破壞性極大，??分值為１．００，而Ａｒｇｌ６７１Ｈｉｓ分值為０．０４５，無法明確該突變的影響（最大分值??為１．００，０到１．００危險(xiǎn)度逐步增高）；ＳＩＦＴ軟件分析Ａｓｐｌ３３Ｖａｌ分值為０，對(duì)??蛋白質(zhì)功能有較大影響，Ａｒｇｌ６７１Ｈｉｓ分值為０．?２６?（分值＜０．?０５即對(duì)蛋白質(zhì)功能??影響較大）；ＰＲ０ＶＥＡＮ軟件分析得出Ａｓｐｌ３３Ｖａｌ分值為－８．?７０８，帶來的破壞性極??大，而Ａｒｇｌ６７１Ｈｉｓ分值為－０．?６６８，軟件對(duì)該突變引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響??保持中立態(tài)度無法判斷（對(duì)蛋白質(zhì)功能有影響參考分界值為－２．５）。Ｍｕｔａｔｉｏｎ??Ｔｅａｓｅｒ軟件分析Ａｓｐｌ３３Ｖａｌ引起氨基酸序列改變，可能影響蛋白質(zhì)功能，??Ａｒｇｌ６７１Ｈｉｓ引起氨基酸替換，未提及對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響。ＰｙＭＯＬ軟件構(gòu)建ＭＣＨ３２??基因純合突變前后蛋白質(zhì)空間構(gòu)象

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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