目的:研究流體剪切力（Fluid shear stress,FSS）通過調控RAW264.7細胞中的細胞外信號調節(jié)激酶5（extracellular-regulated kinase 5,ERK5）信號通路對其向破骨細胞分化及骨吸收功能的影響。方法:設置時間梯度對RAW264.7細胞加載0、15、30、45、60、90min的FSS,通過Western blot檢測FSS對ERK5的作用及最佳作用時間,并驗證XMD8-92對ERK5磷酸化的抑制作用;然后將實驗分組為空白對照組、RANKL組、FSS組及FSS+RANKL組,處理4天后觀察并檢測破骨細胞分化、骨吸收功能及TRAP酶活性;通過使用CCK-8測定法檢測細胞活力;使用Western blot法檢測并分析磷酸化ERK5（p-ERK5）、NFATc1、CTSK、TRAP、MMP-9蛋白的表達。結果:Western blot檢測顯示RANKL對ERK5均無明顯磷酸化激活作用,但加載FSS 30min對ERK5有顯著激活作用,XMD8-92可特異性抑制FSS激活的ERK5磷酸化;細胞計數(shù)、TRAP酶活性及骨吸收實驗顯示,與RANKL組相... 

【文章來源】：蘭州大學甘肅省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

FSS可激活ERK5,但RANKL無明顯激活注:定量分析pERK/ERK5的比值，圖中數(shù)據(jù)顯

蘭州大學碩士學位論文流體剪切應力通過ERK5信號通路抑制RAW264.7細胞的破骨細胞分化163.1.2XMD9-92可抑制FSS可激活的ERK5磷酸化作用FSS對ERK5有直接激活作用,為了驗證XMD8-92對FSS激活的ERK5的磷酸化是否有抑制作用，將實驗分為空白對照組FSS組XMD8-92組和FSS+XMD8-92組,FSS+XMD8-92組在加載FSS之前先加入ERK5特異性抑制劑XMD8-92處理（根據(jù)前期實驗，3μMXMD8-92對RAW264.7細胞中ERK5的抑制效果最佳）,實驗完成立即提取蛋白并通過Westernblot檢測蛋白表達,結果顯示XMD8-92可特異性抑制FSS激活的ERK5磷酸化(圖1,p<0.001)圖2XMD8-92可抑制FSS激活的ERK5磷酸化作用注:定量分析pERK/ERK5比值，圖中數(shù)據(jù)顯示為平均值±標準差,n=3,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0013.2加載FSS對破骨細胞分化及功能的影響3.2.1加載FSS后觀察對破骨細胞分化的影響RAW264.7細胞在有或沒有加RANKL的情況下加載FSS(12dyn/cm2,30min/day)處理4天后染色并進行TRAP酶活性檢測，觀察TRAP染色陽性細胞及540nm吸光度下TRAP酶活性，發(fā)現(xiàn)與RANKL組相比,RANKL+FSS組的TRAP陽性多核細胞顯著減少，且單加FSS組的TRAP染色陽性細胞更少，與空白組無明顯差異（圖3A，B，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001）；FSS組的TRAP酶活性與RANKL組比較也顯著降低，且FSS+RANKL組的TRAP酶活性對比單加RANKL組降低（圖3C，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001），結果顯示FSS對RANKL激活的破骨細胞分化作用及TRAP酶活性有明顯的抑制效果

蘭州大學碩士學位論文流體剪切應力通過ERK5信號通路抑制RAW264.7細胞的破骨細胞分化17圖3FSS可抑制RANKL誘導的破骨細胞分化注：（A，B，C）將RAW264.7細胞加或不加RANKL預處理并隨后加載FSS(12dyn/cm2,30min/day)4天,然后進行TRAP染色并通過ImageJ計數(shù)TRAP陽性多核細胞,在540nm處測量TRAP活性，圖中數(shù)據(jù)顯示為平均值±標準差,n=3,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0013.2.2加載FSS后觀察破骨細胞在骨片上的骨吸收作用FSS組的骨吸收明顯低于RANKL組,并且FSS+RANKL組的結果顯示FSS對RANKL激活的骨吸收作用同樣具有明顯的抑制效應（圖4A，B，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001）；用CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)FSS對RAW264.7細胞無明顯毒性作用,并不會影響細胞活力，實驗中觀察到有極少數(shù)量的細胞在加載FSS時流失,但對實驗結果并沒有實質性影響,可忽略不計(圖4C)圖4FSS可抑制破骨細胞骨吸收功能，但并不影響RAW264.7細胞的活力注:(A，B)通過使用ImageJ分析骨片吸收面積來分析不同分組間破骨細胞的骨吸收能力；(C)在吸光度450nm處測量細胞活力，圖中數(shù)據(jù)顯示為平均值±標準差,n=3,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001


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