類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種以關節(jié)滑膜炎癥為主要病理表現(xiàn)的炎性、慢性、系統(tǒng)性自身免疫病,其發(fā)病機制可能與T細胞、B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和成纖維樣滑膜細胞等各種細胞、炎癥細胞因子共同作用有關,目前還沒有令人滿意的治療方法。腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α,TNF-α）在RA的發(fā)病機制中扮演重要角色,其與細胞上的腫瘤壞死因子受體（tumour necrosis factor receptor,TNFR）結合,在誘導RA炎癥介質的產生、炎癥細胞浸潤、滑膜血管翳形成、骨侵蝕等病理生理過程中起重要作用。臨床上,以依那西普（Etanercept）為代表的TNF-α抑制劑,在治療中重度和難治性RA中起到舉足輕重的作用。Etanercept是人可溶型腫瘤壞死因子受體Ⅱ（soluble tumour necrosis factor receptorⅡ,sTNFRⅡ）與人免疫球蛋白（immune globulin,Ig）G1的Fc段構建的融合蛋白,作為一種假受體,通過競爭性地結合TNF-α,阻斷了TNF-α信號的傳遞,從而抑制... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學安徽省

【文章頁數】：153 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
英文縮略詞表(ABBREVIATION)
中文摘要
ABSTRACT
1 前言
2 實驗材料
    2.1 人滑膜組織樣本
    2.2 細胞
    2.3 動物
    2.4 藥物與試劑
    2.5 儀器
3 實驗方法
    3.1 人臍帶間充質干細胞的培養(yǎng)和傳代
    3.2 人臍帶間充質干細胞的凍存和復蘇
    3.3 人臍帶間充質干細胞的鑒定
        3.3.1 表面分子標記物的檢測
        3.3.2 成骨能力檢測
        3.3.3 成脂能力檢測
        3.3.4 成軟骨能力檢測
    3.4 STNFRⅡ-FC過表達慢病毒載體的構建、包裝和檢測
        3.4.1 sTNFRⅡ-Fc過表達慢病毒克隆的構建
        3.4.2 sTNFRⅡ-Fc蛋白表達檢測
        3.4.3 sTNFRⅡ-Fc過表達慢病毒載體的包裝
        3.4.4 sTNFRⅡ-Fc過表達慢病毒載體的質量檢測
    3.5 STNFRⅡ-FC過表達UC-MSC穩(wěn)定細胞株(STNFRⅡ-MSC)的構建
        3.5.1 篩選穩(wěn)定細胞株的puro最佳濃度
        3.5.2 確定UC-MSC的最佳轉染條件
        3.5.3 sTNFRⅡ-Fc過表達慢病毒轉染UC-MSC
        3.5.4 sTNFRⅡ-MSC穩(wěn)定細胞株的篩選和擴大培養(yǎng)
        3.5.5 穩(wěn)定細胞株純度檢測
    3.6 STNFRⅡ-MSC體外功能特性的確定
        3.6.1 ELISA法檢測sTNFRⅡ-MSC分泌sTNFRⅡ-Fc的水平
        3.6.2 sTNFRⅡ-MSC表面分子標記物的檢測
        3.6.3 sTNFRⅡ-MSC分化能力的檢測
        3.6.4 MSC條件培養(yǎng)基的獲取
        3.6.5 激光共聚焦法檢測sTNFRⅡ-MSC中 ICAM-1和VCAM-1 的表達
        3.6.6 Western Blot法檢測sTNFRⅡ-MSC中 ICAM-1和VCAM-1 的表達
        3.6.7 ELISA檢測sTNFRⅡ-MSC與 FLS共培養(yǎng)體系中RANKL和OPG的水平
    3.7 STNFRⅡ-MSC體內功能特性的確定
    3.8 STNFRⅡ-MSC對小鼠CIA的作用
        3.8.1 制備小鼠CIA模型
        3.8.2 實驗分組和給藥方法
        3.8.3 整體指標觀察
        3.8.4 踝關節(jié)病理學檢測和評分
        3.8.5 脾臟病理學檢測和評分
        3.8.6 免疫學指標檢測
        3.8.7 免疫組化法檢測踝關節(jié)軟骨和滑膜組織中MMP-13、TIMP-1、ADAMTS-5和CollagenⅡ的表達
    3.9 QPCR法檢測STNFRⅡ-MSC對 CIA小鼠脾臟CD4+T 細胞亞群相關轉錄因子mRNA表達的影響
        3.9.1 sTNFRⅡ-MSC與 CIA小鼠脾臟CD4+T 細胞共培養(yǎng)
        3.9.2 小鼠脾臟CD4+T 細胞RNA的提取
        3.9.3 RNA逆轉錄成c DNA
        3.9.4 Th17、Th1、Th2、Treg和 Tfh相關轉錄因子引物序列
        3.9.5 QPCR法檢測CD4+T 細胞相關轉錄因子m RNA表達
    3.10 免疫熒光法檢測STNFRⅡ-MSC在 CIA小鼠脾臟和關節(jié)組織中的留存時間
    3.11 免疫熒光法檢測CIA小鼠脾臟留存的STNFRⅡ-MSC中LC3B-Ⅱ和Cleaved caspase3 表達情況
    3.12 TUNEL法檢測STNFRⅡ-MSC凋亡
    3.13 Annexin V/PI法檢測STNFRⅡ-MSC凋亡
    3.14 Western Blot法檢測STNFRⅡ-MSC中 Bax、Bcl2、Caspase8、Caspase3、Cleaved caspase8、Cleaved caspase3、LC3B-Ⅱ和TRIB3的蛋白表達
    3.15 CCK-8 法檢測自噬和凋亡對STNFRⅡ-MSC免疫抑制能力的影響
    3.16 Western Blot法檢測STNFRⅡ-MSC中 SOX-9和Aggrecan蛋白表達
    3.17 統(tǒng)計學分析
4 結果
    4.1 UC-MSC的鑒定
    4.2 STNFRⅡ-FC過表達慢病毒載體的構建、包裝和檢測
        4.2.1 GV358載體酶切結果
        4.2.2 sTNFRⅡ-Fc融合蛋白基因片段的獲取
        4.2.3 sTNFRⅡ-Fc融合蛋白基因與載體進行交換
        4.2.4 陽性克隆測序
        4.2.5 質粒表達檢測
        4.2.6 sTNFRⅡ-Fc過表達慢病毒載體質量檢測
        4.2.7 sTNFRⅡ-Fc過表達慢病毒載體滴度檢測
    4.3 STNFRⅡ-MSC穩(wěn)定細胞株的構建
        4.3.1 篩選sTNFRⅡ-MSC穩(wěn)定細胞株的puro最佳濃度
        4.3.2 sTNFRⅡ-Fc慢病毒轉染UC-MSC的最佳轉染條件
        4.3.3 sTNFRⅡ-MSC單克隆穩(wěn)定細胞株的篩選
        4.3.4 sTNFRⅡ-MSC穩(wěn)定細胞株純度檢測
    4.4 STNFRⅡ-MSC體外功能特性的確定
        4.4.1 sTNFRⅡ-MSC分泌sTNFRⅡ-Fc的水平
        4.4.2 sTNFRⅡ-MSC表面分子標記物檢測
        4.4.3 sTNFRⅡ-MSC分化能力檢測
        4.4.4 sTNFRⅡ-MSC條件培養(yǎng)液對UC-MSC中ICAM-1和VCAM-1表達的影響
        4.4.5 TNF-α和 IL-1β對 sTNFRⅡ-MSC中 ICAM-1和VCAM-1 表達的影響
        4.4.6 sTNFRⅡ-MSC和 FLS共培養(yǎng)體系中RANKL和 OPG的水平
    4.5 STNFRⅡ-MSC體內功能特性的確定
    4.6 細胞存活率檢測
    4.7 STNFRⅡ-MSC對 CIA小鼠整體指標的影響
        4.7.1 sTNFRⅡ-MSC對 CIA小鼠體重的影響
        4.7.2 sTNFRⅡ-MSC對 CIA小鼠關節(jié)炎指數和關節(jié)腫脹數的影響
    4.8 STNFRⅡ-MSC對 CIA小鼠脾臟病理的影響
    4.9 STNFRⅡ-MSC對 CIA小鼠踝關節(jié)病理的影響
    4.10 STNFRⅡ-MSC對 CIA小鼠免疫學指標的影響
        4.10.1 sTNFRⅡ-MSC對 CIA小鼠胸腺和脾臟指數的影響
        4.10.2 sTNFRⅡ-MSC對 CIA小鼠胸腺T細胞和脾臟B細胞增殖的影響
        4.10.3 sTNFRⅡ-MSC對 CCⅡ特異的CD4+T 細胞增殖的影響
        4.10.4 sTNFRⅡ-MSC對 CIA小鼠脾臟Th1、Th2、Th17、Treg和Tfh細胞亞群的影響
        4.10.5 sTNFRⅡ-MSC對 CIA小鼠脾臟漿細胞和Breg細胞亞群的影響
        4.10.6 sTNFRⅡ-MSC對 CIA小鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-4和IL-10水平的影響
        4.10.7 sTNFRⅡ-MSC對 CIA小鼠血清IgG1、IgG2a和抗CCⅡ抗體水平的影響
    4.11 STNFRⅡ-MSC對 CIA小鼠踝關節(jié)軟骨MMP-13、TIMP-1、ADAMTS-5和CollagenⅡ表達的影響
    4.12 STNFRⅡ-MSC對 CIA小鼠踝關節(jié)滑膜組織中MMP-13、TIMP-1和ADAMTS-5 表達的影響
    4.13 sTNFRⅡ-MSC對 CIA小鼠脾臟CD4+T 細胞相關轉錄因子表達的影響
    4.14 STNFRⅡ-MSC在不同病程CIA小鼠脾臟組織中的分布情況
    4.15 STNFRⅡ-MSC在不同病程CIA小鼠踝關節(jié)組織中的分布情況
    4.16 遷移至CIA小鼠脾臟組織中的STNFRⅡ-MSC上 LC3B-Ⅱ和Cleaved caspase3 的表達情況
    4.17 TNF-α對 STNFRⅡ-MSC功能的影響
        4.17.1 TNF-α對 sTNFRⅡ-MSC凋亡和自噬的影響
        4.17.2 TNF-α對 sTNFRⅡ-MSC成軟骨功能的影響
5 討論
6 結論
7 課題創(chuàng)新點
8 下一步計劃
參考文獻
附錄
致謝
綜述:間充質干細胞通過調控記憶T細胞治療類風濕關節(jié)炎的研究進展
    參考文獻



本文編號：3465002