目的:通過小分子化合物分階段將小鼠肝細(xì)胞重編程為胰島素分泌細(xì)胞（insulin producing cells,IPCs）,建立一種用非轉(zhuǎn)基因方式重編程原代肝細(xì)胞為胰島素分泌細(xì)胞的方法并探索miRNA-124-3p在誘導(dǎo)分化過程中的機(jī)制。方法:小鼠原代肝細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定,利用各類小分子化合物分階段將肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞,通過qPCR、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)分化各階段標(biāo)志物的表達(dá),通過胰島素釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IPCs的功能。設(shè)計(jì)miRNA-124-3p類似物（mimic）和抑制劑（inhibitor）序列,將mimic和inhibitor分別轉(zhuǎn)染至小鼠肝細(xì)胞,并通過qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miRNA-124-3p和靶基因Foxa2表達(dá)量變化,以此來判斷載體是否構(gòu)建成功,再將miR-124-3p上調(diào)和下調(diào)后的肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化為IPCs,采用qRT-PCR,細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)miRNA-124-3p上調(diào)及下調(diào)后誘導(dǎo)各階段胰島素發(fā)育相關(guān)基因及蛋白表達(dá)量變化。小鼠胰島素酶聯(lián)免疫分析（ELISA）檢測(cè)各階段細(xì)胞分泌胰島素的差異。結(jié)果:1.糖原染色顯示分離得到的細(xì)胞為含有糖原顆粒的肝細(xì)胞,通過細(xì)胞免疫熒光染... 

【文章來源】：南昌大學(xué)江西省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：54 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

小鼠原代肝細(xì)胞的形態(tài)觀察及鑒定A小鼠肝細(xì)胞的形態(tài)(Scalebar400μm)；B糖原染色鑒定肝細(xì)胞(Scalebar100μm)；C細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)肝細(xì)胞標(biāo)志蛋白CK18和ALB的表達(dá)(Scalebar100μm)

第 3 章 結(jié)果形態(tài)變化細(xì)胞F1代在第一階段經(jīng)基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基和小分子化合物、TSA 誘導(dǎo)培養(yǎng) 1 天后，顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖明顯降低梭形，細(xì)胞質(zhì)變扁平，核變大，細(xì)胞呈現(xiàn)出一種去分化成誘導(dǎo)第一階段細(xì)胞（圖 2B）；經(jīng)基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加 子作用 7 天后得到誘導(dǎo)第二階段的細(xì)胞，即胰腺前體細(xì)，細(xì)胞仍呈梭形，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞之間間隙增大（圖誘導(dǎo)第二階段基礎(chǔ)培養(yǎng)基及小分子化合物 NA 作用下，經(jīng)成 IPCs，此時(shí)細(xì)胞數(shù)量較前幾個(gè)階段減少顯著，細(xì)胞核漿細(xì)胞逐漸聚集成簇（圖 2D）。

第 3 章 結(jié)果的肝細(xì)胞表面標(biāo)志物ALB和AFP的表達(dá)明顯下調(diào)，多譜系前體細(xì)胞標(biāo)志物nestin和肝胰腸祖細(xì)胞標(biāo)志物 Sox9 表達(dá)顯著上調(diào)（圖 3A），說明具備了多能祖細(xì)胞的特性。在第二階段誘導(dǎo)結(jié)束后，檢測(cè)到下調(diào)的 Sox9 和 nestin，以及與多能祖細(xì)胞相比上調(diào)的 Pdx1，Ngn3 和 NeuroD (圖 3B)表達(dá)，顯示胰腺祖細(xì)胞的成功誘導(dǎo)。經(jīng)過第三階段進(jìn)一步的誘導(dǎo)分化，在 IPCs 中觀察到 Pdx1，Ngn3 和 NeuroD，特別是 NeuroD 的顯著降低。還有 β 細(xì)胞功能相關(guān)基因 GK，Glut2 和 insulin1 基因的表達(dá)在第 3 階段的細(xì)胞中比在第 2 階段的細(xì)胞上調(diào)(圖 3C)，誘導(dǎo)分化過程中無胰高血糖素（glucagon）、生長(zhǎng)抑素（somatostatin）、胰多肽（PP）等胰腺內(nèi)分泌相關(guān)基因和胰腺外分泌基因淀粉酶（amylase）的表達(dá)（圖 3D）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]敲低賴氨酸特異性去甲基化酶1（LSD1）促進(jìn)人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞分化為產(chǎn)胰島素細(xì)胞[J]. 周淑艷,李富榮,李陽(yáng),張翠,孫瑤,張根葆.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2018(08)
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