胰腺β細胞是機體合成和分泌胰島素的重要場所,其功能紊亂是導(dǎo)致糖尿病的重要因素。之前的研究表明胰腺β細胞中,表皮生長因子（EGF）和microRNA-124a（miR-124a）在胰島素生物合成和分泌中起相反的作用,但是其相互調(diào)控機制仍然知之甚少。在本研究中,首先向MIN6和INS1細胞中添加EGF、EGFR抑制劑以及ERK和AKT抑制劑處理,qPCR檢測miR-124a的表達量,證明了 EGF可以通過下游信號通路促分裂原激活的蛋白激酶激酶（MEK）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）級聯(lián)抑制β細胞系中miR-124a的表達。其次,Western Blotting檢測ETS2及其磷酸化蛋白水平變化,發(fā)現(xiàn)EGF處理可以增加ETS2的磷酸化水平,且ETS2與miR-124a的表達量一直呈現(xiàn)負相關(guān),由此確定ETS（E26轉(zhuǎn)化特異性）家族的成員轉(zhuǎn)錄因子ETS2參與這一調(diào)控,且這需要ETS2蘇氨酸72位的磷酸化。然后,經(jīng)過結(jié)合位點預(yù)測以及雙熒光素酶載體報告體系鑒定,我們確認(rèn)ETS2可以結(jié)合位于不同染色體上的三個miR-124a啟動子中的保守結(jié)合位點AGGAANA/TN,從而在轉(zhuǎn)錄水平上降低了 miR-... 

【文章來源】：東北林業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－１?ＥＧＦ抑制ｍｉＲ－ｌ２４ａ的表達??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１?ＥＧＦ?ｉｎｈｉｂｉｔｓ?ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ｍｉＲ－１２４ａ??Ａ：?ＥＧＦ理；Ｂ：?ＭＩ?

圖２－２?ＥＧＦ通過ＥＲＫ及ＰＩ３Ｋ抑制ｍｉＲ－１２４ａ的表達??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２?ＥＧＦ?ｉｎｈｉｂｉｔｓ?ｍｉＲ－１２４ａ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｔｈｒｏｕｇｈ?ＥＲＫ?ａｎｄ?ＰＩ３Ｋ??

?東北林業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文???３．４．２?ＥＴＳ２調(diào)控ｍｉＲ－１２４ａ表達依賴于其鱗酸化的活化??將ＥＴＳ２的關(guān)鍵磷酸位點７２位蘇氨酸（Ｔ７２）的磷酸化突變?yōu)楸彼幔ㄒ裕裕罚玻帘??示），構(gòu)建ＥＴＳ２磷酸化不敏感型突變體。當(dāng)ＥＴＳ２的突變型過表達時，即使ＥＴＳ２蛋白??水平上升，也未觀察到Ｔ７２位點的磷酸化，此時ｍｉＲ－１２４ａ表達也未顯現(xiàn)出明顯變化??（圖３－２Ａ）。接下來還檢查了預(yù)先通過ｓｉＲＮＡ降低五：ＴＳ２表達后，再用ＥＧＦ處理，對??ｍｉＲ－１２４ａ表達的影響。先在ＭＩＮ６細胞中先用ｓｉＥＴＳ２或ｓｉＮＣ轉(zhuǎn)染３６?ｈ，然后按照前述??ＥＧＦ處理方式，將轉(zhuǎn)染后的細胞血清饑餓１２?ｈ，再加入ＥＧＦ進行處理。以此檢測該條??件下的ｍｉＲ－１２４ａ的表達，并通過Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔｔｉｎｇ檢測ＥＴＳ２憐酸化和總ＥＴＳ２的表??達。對照組轉(zhuǎn)染ｓｉＮＣ與前述結(jié)果一致，ＥＧＦ能夠促進ＥＴＳ２磷酸化。在ｓｉＥＴＳ２干涉條??件下，ＥＴＳ２的磷酸化作用減弱，同時發(fā)現(xiàn)用ｓｉＥＴＳ２的預(yù)處理可以緩解ＥＧＦ對ｍｉＲ－??１２４ａ表達的抑制作用（圖３－２?Ｂ），表明ＥＴＳ２對于這種抑制作用至關(guān)重要。此外，先轉(zhuǎn)??染含有野生型（ＷＴ）?ＥＴＳ２編碼序列的載體或?qū)φ蛰d體４８ｈ，然后用ＤＭＳＯ、Ｕ０１２６、??ＬＹ２９４００２和Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ分別處理，發(fā)現(xiàn)在減弱過表達引起的ＥＴＳ２磷酸化水平升高的同??時，ＭＥＫ，ＰＩ３Ｋ和ＥＧＦＲ抑制劑都可逆轉(zhuǎn)ＥＴＳ２過表達誘導(dǎo)的ｍｉＲ－１２４ａ表達下降（圖??Ｃ）。并且普遍觀察到了?ＥＴＳ２磷酸化和ｍｉＲ－１２４ａ表達之間的負相關(guān)性（圖３－２Ｂ，２??Ｃ）。這些結(jié)果表明，ＥＴＳ２參與了?ｍｉ

【參考文獻】：
期刊論文
[1]miR-124a通過抑制TGF-β通路促進人胎盤間充質(zhì)干細胞向胰腺祖細胞分化[J]. 陳冬梅,馬海濱,劉淑丹,王立斌,李玉奎,魏軍.  基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床. 2014(10)
[2]microRNA與胰腺發(fā)育以及干細胞分化的研究進展[J]. 趙荷珺,魏蕊,洪天配.  世界華人消化雜志. 2012(21)



本文編號：3393163