發(fā)布時(shí)間：2021-05-21 11:39

　　目的:成人主動(dòng)脈根部擴(kuò)張及主動(dòng)脈瘤的形成是馬凡氏綜合征最常見的心血管癥狀及并發(fā)癥;主動(dòng)脈血管壁中膜平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）功能障礙是導(dǎo)致病變的關(guān)鍵因素。本研究探討TGF-β介導(dǎo)馬凡氏綜合征主動(dòng)脈VSMCs衰老的機(jī)制,為臨床上馬凡氏綜合征主動(dòng)脈病變的早期干預(yù)和治療提供新的策略和理論基礎(chǔ)。方法:分別選取臨床上器官捐獻(xiàn)供體和行主動(dòng)脈手術(shù)的馬凡氏綜合征患者主動(dòng)脈組織,然后分離、培養(yǎng)、鑒定兩組主動(dòng)脈VSMCs。運(yùn)用H&E染色、SA-β-gal染色、Ki67增殖實(shí)驗(yàn)、免疫熒光染色比較兩組主動(dòng)脈組織中膜VSMCs增殖及衰老情況的差異。ELISA檢測(cè)對(duì)比兩組細(xì)胞培養(yǎng)基中衰老相關(guān)分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP）IL-6、IL-8、TNF-α、INF-y的濃度。將供體血管平滑肌細(xì)胞分為三組,其中兩組分別加入TGF-β1（50ng/ml）和TGF-β1+TGF-β1-siRNA干預(yù)48 h后檢測(cè)三組細(xì)胞衰老程度的情況,探討TGF-β誘導(dǎo)主動(dòng)脈VSMCs衰老的作用。運(yùn)用DH... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 馬凡氏綜合征及其并發(fā)癥
    1.2 血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)損傷與主動(dòng)脈瘤
        1.2.1 VSMCs
        1.2.2 VSMCs損傷與主動(dòng)脈瘤的形成
    1.3 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β及其生物學(xué)功能
    1.4 ROS/NF-κB信號(hào)通路與細(xì)胞衰老
        1.4.1 活性氧
        1.4.2 核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)
        1.4.3 衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)
    1.5 研究假設(shè)
第二章 馬凡氏綜合征主動(dòng)脈組織與供體主動(dòng)脈組織衰老表型的比較
    2.1 前言
    2.2 組織標(biāo)本和實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 主動(dòng)脈組織
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 主動(dòng)脈組織的石蠟包埋
        2.3.2 蘇木素伊紅染色(hematoxylin and eosin staining,H&E staining)
        2.3.3 總蛋白質(zhì)的提取
        2.3.4 蛋白質(zhì)濃度測(cè)量
        2.3.5 蛋白質(zhì)垂直凝膠電泳分離
        2.3.6 轉(zhuǎn)膜
        2.3.7 封閉、孵育及顯色分析
        2.3.8 主動(dòng)脈組織切片的SA-β-gal染色
        2.3.9 主動(dòng)脈組織切片衰老相關(guān)蛋白p53和平滑肌細(xì)胞標(biāo)記蛋白α-SMA的免疫熒光染色
        2.3.10 統(tǒng)計(jì)方法
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 MFS患者及器官捐獻(xiàn)供體的基本信息
        2.4.2 MFS患者主動(dòng)脈中膜發(fā)生囊性變并出現(xiàn)退化
        2.4.3 MFS患者主動(dòng)脈組織中細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白表達(dá)增多
        2.4.4 MFS患者主動(dòng)脈組織中發(fā)生衰老的細(xì)胞類型主要為中膜平滑肌細(xì)胞
    2.5 實(shí)驗(yàn)討論
    2.6 本章小結(jié)
第三章 馬凡氏綜合征及供體主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞衰老表型的比較
    3.1 前言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
        3.3.2 細(xì)胞的凍存
        3.3.3 細(xì)胞的復(fù)蘇
        3.3.4 兩組培養(yǎng)細(xì)胞α-SMA和calponin免疫熒光染色鑒定
        3.3.5 兩組VSMCs形態(tài)大小的比較
        3.3.6 兩組VSMCs SA-β-gal染色
        3.3.7 ki67免疫熒光染色比較兩組VSMCs的增殖能力
        3.3.8 Western Blot法檢測(cè)兩組VSMCs中p53及p21的水平
        3.3.9 ELISA檢測(cè)兩組VSMCs培養(yǎng)基中衰老相關(guān)分泌表型(SASP)水平
        3.3.10 統(tǒng)計(jì)方法
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 器官捐獻(xiàn)供體與MFS患者主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的鑒定
        3.4.2 MFS-VSMCs體積增大,SA-β-gal染色陽性率增高,細(xì)胞增殖能力降低
        3.4.3 MFS-VSMCs衰老相關(guān)蛋白p21、p53的表達(dá)增多
        3.4.4 MFS-VSMCs培養(yǎng)基中SASP(IL-6、IL-8、TNF-α、INF-γ)濃度升高
    3.5 實(shí)驗(yàn)討論
    3.6 本章小結(jié)
第四章 TGF-β1誘導(dǎo)主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞衰老的研究
    4.1 前言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 MFS患者與器官捐獻(xiàn)供體血清和主動(dòng)脈組織中TGF-β1水平的測(cè)定
        4.3.2 Western Blot檢測(cè)兩組血管平滑肌細(xì)胞中TGF-β1的水平
        4.3.3 siRNA(Small-interfering RNA)沉默目的蛋白基因表達(dá)
        4.3.4 Western Blot檢測(cè)各組Control-VSMCs干預(yù)后TGF-β1、p53、p21水平的變化
        4.3.5 SA-β-gal染色檢測(cè)各組Control-VSMCs干預(yù)后的衰老情況
        4.3.6 統(tǒng)計(jì)方法
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 MFS患者的血清和主動(dòng)脈組織中TGF-β1水平升高
        4.4.2 TGF-β1促進(jìn)Control-VSMCs衰老
    4.5 實(shí)驗(yàn)討論
    4.6 本章小結(jié)
第五章 TGF-β促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞衰老機(jī)制的探討
    5.1 前言
    5.2 實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 DHE染色檢測(cè)MFS患者與器官捐獻(xiàn)供體主動(dòng)脈組織中ROS的水平
        5.3.2 線粒體活性氧水平的檢測(cè)(Mito-Sox染色)
        5.3.3 兩組VSMCs NF-κB活化情況比較(p-65- NF-κB免疫熒光染色)
        5.3.4 Western Blot檢測(cè)各組VSMCs干預(yù)后目的蛋白表達(dá)水平變化
        5.3.5 SA-β-gal檢測(cè)各組Control-VSMCs干預(yù)后的衰老情況
        5.3.6 ELISA檢測(cè)各組Control-VSMCs干預(yù)后培養(yǎng)基中SASP的濃度
        5.3.7 統(tǒng)計(jì)方法
    5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.4.1 MFS患者主動(dòng)脈組織及細(xì)胞線粒體中ROS水平升高
        5.4.2 TGF-β1促進(jìn)Control-VSMCs線粒體活性氧產(chǎn)生
        5.4.3 TGF-β1通過ROS/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)VSMCs衰老
    5.5 實(shí)驗(yàn)討論
    5.6 本章小結(jié)
結(jié)論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間成果
致謝



本文編號(hào)：3199641