目的探討Wnt3a在百草枯誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及其分子機(jī)制。方法使用百草枯（Paraquat,PQ,50 μmol/L）誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞（HBE）,采用Western Blot和q-PCR技術(shù),檢測上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-Cadherin、Occludin和成纖維細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA、Vimentin等蛋白的表達(dá)水平變化,驗證百草枯誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）模型的建立。使用Wnt3a人重組細(xì)胞因子（100μg/ml）誘導(dǎo)HBE,采用Western Blot和q-PCR技術(shù),檢測上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin、Occludin和成纖維細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA、Vimentin以及Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平,驗證Wnt/β-catenin信號通路的激活。設(shè)計并構(gòu)建針對Wnt3a的siRNA片段和陰性對照,轉(zhuǎn)染HBE細(xì)胞,下調(diào)Wnt3a蛋白表達(dá)水平,同時采用百草枯誘導(dǎo),檢測E-cadherin、Occludin、α-SMA、Vimentin的表達(dá)水平,觀察抑制Wnt3... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖３－ｌ?Ａ：電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；Ｂ：ｑ－ＰＣＲ檢測上皮細(xì)胞標(biāo)記物和成纖維細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)??水平；ＣＷｅｓｔｅｍ?Ｂｌｏｔ檢測上皮細(xì)胞標(biāo)記物和成纖維細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)水平??

????４．ｓｉＲＮＡ下調(diào)靶基因Ｗｎｔ３ａ表達(dá)水平，能夠抑制ＰＱ激活的??Ｗｎｔ／ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ信號通路，阻斷ＰＱ誘導(dǎo)的ＥＭＴ進(jìn)程??根據(jù)Ｗｎｔ３ａ的核酸序列，設(shè)計并構(gòu)建Ｗｎｔ３ａ的特異性ｓｉＲＮＡ片段轉(zhuǎn)染ＨＢＥ，??Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ檢測結(jié)果顯示，和陰性對照組相比，Ｗｎｔ３ａ－ｓｉＲＮＡ處理組Ｗｎｔ３ａ表??達(dá)水平顯著下調(diào)（如圖３－４所示），證明了靶向干擾Ｗｎｔ３ａ的效果。Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ??和ｑ－ＰＣＲ檢測結(jié)果顯示，和ＰＱ組對比，Ｗｎｔ３ａ－ｓｉＲＮＡ處理組Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ的表達(dá)??水平下降（如圖３－５Ａ、圖３－５Ｂ所示），表明Ｗｎｔ３ａ－ｓｉＲＮＡ能夠抑制ＰＱ激活的??Ｗｎｔ／ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ信號通路。同時，和ＰＱ組相比，Ｗｎｔ３ａ－ｓｉＲＮＡ組上皮細(xì)胞標(biāo)志物??Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ表達(dá)水平升高，纖維細(xì)胞標(biāo)志物ａ－ＳＭＡ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ的表達(dá)水平下降，??說明靶向下調(diào)Ｗｎｔ３ａ的表達(dá)水平（如圖３－５Ａ、圖３－５Ｂ所示），能阻斷ＰＱ誘導(dǎo)??的ＥＭＴ進(jìn)程。上述結(jié)果提示Ｗｎｔ／ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ信號通路在百草枯誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)??胞ＥＭＴ發(fā)生過程中起著重要的調(diào)控作用。??．?▲一－一??Ｗｎｔ３ａ（３９ｋＤａ）??ｐ－ａｃｔｉｎ（４２?ｋＤａ）?ｍｍｍ??圖３－４靶向性干擾Ｗｎｔ３ａ的表達(dá)水平，驗證ｓｉＲＮＡ的干擾效果??Ｆｉｇｕｒｅ?３－４?Ｔａｒｇｅｔｅｄ?ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ?ｗｉｔｈ?ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｌｅｖｅｌ?ｏｆ?Ｗｎｔ３ａ?ｔｏ?ｖｅｒｉｆｙ?ｔｈｅ?ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ??ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｓｉＲＮＡ??２０??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3144404