目的:高脂血癥是一種由基因和環(huán)境因素共同引起的代謝性疾病,其主要危害是易引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化病變,由此導(dǎo)致的慢性心腦血管疾病已經(jīng)是威脅人類(lèi)健康的重要疾病之一。合適的動(dòng)物模型是研究疾病的重要工具,本文主要是利用CRISPR/Cas9技術(shù)來(lái)建立ApoE基因敲除的新型金黃倉(cāng)鼠高脂血癥模型,并鑒定其表型。方法:載脂蛋白E（ApoE）是參與脂質(zhì)代謝的一個(gè)關(guān)鍵基因。本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),設(shè)計(jì)了2對(duì)靶向金黃倉(cāng)鼠ApoE基因第4個(gè)外顯子的sg RNA（sg RNA 1,sg RNA2）。通過(guò)酶切和連接反應(yīng)把合成的sg RNA序列連接到PX458質(zhì)粒上構(gòu)建sg RNA-質(zhì)粒載體,Sanger測(cè)序和酶切反應(yīng)驗(yàn)證質(zhì)粒載體的正確性。用sg RNA-質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后,通過(guò)熒光強(qiáng)度以及酶切反應(yīng)驗(yàn)證sg RNA的敲除效率,選擇效率高的sg RNA用于受精卵顯微注射。把注射后的受精卵移植到代孕金黃倉(cāng)鼠中,約2周后幼崽金黃倉(cāng)鼠（即F0代）出生。待F0代金黃倉(cāng)鼠生長(zhǎng)至2周齡時(shí),剪取腳趾做標(biāo)記并收集腳趾組織用于提取基因組DNA和PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化后做載體克隆,挑取單克隆做Sange... 

【文章來(lái)源】：鄭州大學(xué)河南省 211工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

ApoE基因打靶模式圖

第一章構(gòu)建ApoE基因敲除的金黃倉(cāng)鼠17圖1.2載體驗(yàn)證及體外效率檢測(cè)。用Sanger測(cè)序（A-B）和酶切分析（C）驗(yàn)證sgRNA質(zhì)粒載體；（D）sgRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞；（E）酶切驗(yàn)證sgRNA在BHK-21細(xì)胞中的工作效率。Fig1.2TheefficiencyofsgRNAinvitro.VerificationofthesgRNA-plasmidvectorbySangersequencing(A-B)andCleavageassay(C)；(D)BHK-21cellstransfectedbysgRNA-plasmidvector.(E)TheefficiencyofsgRNAinBHK-21cellbyCleavageassay.3.2F0代金黃倉(cāng)鼠基因型鑒定通過(guò)顯微注射技術(shù)把sgRNA2質(zhì)粒載體注射到53枚金黃倉(cāng)鼠受精卵中，最后胚胎移植46枚。16天后出生6只F0代金黃倉(cāng)鼠，其中雌性4只（F0-1、F0-3、F0-5、F0-6）雄性2只（F0-2、F0-4）。3周后采集剪去的金黃倉(cāng)鼠腳趾組織并提取基因組DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行載體克隆，利用Sanger測(cè)序來(lái)檢測(cè)F0代金黃倉(cāng)鼠的基因型。結(jié)果如圖1.3所示，6只F0代金黃倉(cāng)鼠中有一只（F0-6）其基因型為野生型，其余5只F0金黃倉(cāng)鼠的ApoE基因均被成功修飾，編輯效率為83.3%（5/6）；這5只倉(cāng)鼠中共檢出包括7種突變基因型。其中F0-1和F0-2個(gè)體均只攜帶1個(gè)突變基因型，分別刪除了79個(gè)堿基和12個(gè)堿基；F0-3個(gè)體攜帶2個(gè)突變基因型，分別為刪除了1個(gè)和21個(gè)堿基；F0-4個(gè)

第一章構(gòu)建ApoE基因敲除的金黃倉(cāng)鼠18體攜帶3個(gè)突變基因型，分別為刪除了1、3、7個(gè)堿基；F0-5個(gè)體攜帶2基因型，其中一個(gè)刪除了7個(gè)堿基，而另外一個(gè)為插入了1個(gè)堿基。圖1.3F0代金黃倉(cāng)鼠基因型檢測(cè)。紅色代表PAM序列，藍(lán)色代表sgRNA打靶序列，紫色代表插入堿基。Fig.1.3ValidationofthegenotypesofallF0usingSangersequencing.sgRNAtargetsitesandPAMsequencesareshowinredandbluelettersrespectively,thebaseCinpurpleofF0-5indicatedthesinglebaseinsert.


本文編號(hào)：3101221