目的:高脂血癥是一種由基因和環(huán)境因素共同引起的代謝性疾病,其主要危害是易引發(fā)動脈粥樣硬化病變,由此導致的慢性心腦血管疾病已經(jīng)是威脅人類健康的重要疾病之一。合適的動物模型是研究疾病的重要工具,本文主要是利用CRISPR/Cas9技術(shù)來建立ApoE基因敲除的新型金黃倉鼠高脂血癥模型,并鑒定其表型。方法:載脂蛋白E（ApoE）是參與脂質(zhì)代謝的一個關(guān)鍵基因。本實驗利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),設(shè)計了2對靶向金黃倉鼠ApoE基因第4個外顯子的sg RNA（sg RNA 1,sg RNA2）。通過酶切和連接反應把合成的sg RNA序列連接到PX458質(zhì)粒上構(gòu)建sg RNA-質(zhì)粒載體,Sanger測序和酶切反應驗證質(zhì)粒載體的正確性。用sg RNA-質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后,通過熒光強度以及酶切反應驗證sg RNA的敲除效率,選擇效率高的sg RNA用于受精卵顯微注射。把注射后的受精卵移植到代孕金黃倉鼠中,約2周后幼崽金黃倉鼠（即F0代）出生。待F0代金黃倉鼠生長至2周齡時,剪取腳趾做標記并收集腳趾組織用于提取基因組DNA和PCR擴增。PCR產(chǎn)物純化后做載體克隆,挑取單克隆做Sange... 

【文章來源】：鄭州大學河南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

ApoE基因打靶模式圖

第一章構(gòu)建ApoE基因敲除的金黃倉鼠17圖1.2載體驗證及體外效率檢測。用Sanger測序（A-B）和酶切分析（C）驗證sgRNA質(zhì)粒載體；（D）sgRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染BHK-21細胞；（E）酶切驗證sgRNA在BHK-21細胞中的工作效率。Fig1.2TheefficiencyofsgRNAinvitro.VerificationofthesgRNA-plasmidvectorbySangersequencing(A-B)andCleavageassay(C)；(D)BHK-21cellstransfectedbysgRNA-plasmidvector.(E)TheefficiencyofsgRNAinBHK-21cellbyCleavageassay.3.2F0代金黃倉鼠基因型鑒定通過顯微注射技術(shù)把sgRNA2質(zhì)粒載體注射到53枚金黃倉鼠受精卵中，最后胚胎移植46枚。16天后出生6只F0代金黃倉鼠，其中雌性4只（F0-1、F0-3、F0-5、F0-6）雄性2只（F0-2、F0-4）。3周后采集剪去的金黃倉鼠腳趾組織并提取基因組DNA并進行PCR擴增。純化后的PCR產(chǎn)物進行載體克隆，利用Sanger測序來檢測F0代金黃倉鼠的基因型。結(jié)果如圖1.3所示，6只F0代金黃倉鼠中有一只（F0-6）其基因型為野生型，其余5只F0金黃倉鼠的ApoE基因均被成功修飾，編輯效率為83.3%（5/6）；這5只倉鼠中共檢出包括7種突變基因型。其中F0-1和F0-2個體均只攜帶1個突變基因型，分別刪除了79個堿基和12個堿基；F0-3個體攜帶2個突變基因型，分別為刪除了1個和21個堿基；F0-4個

第一章構(gòu)建ApoE基因敲除的金黃倉鼠18體攜帶3個突變基因型，分別為刪除了1、3、7個堿基；F0-5個體攜帶2基因型，其中一個刪除了7個堿基，而另外一個為插入了1個堿基。圖1.3F0代金黃倉鼠基因型檢測。紅色代表PAM序列，藍色代表sgRNA打靶序列，紫色代表插入堿基。Fig.1.3ValidationofthegenotypesofallF0usingSangersequencing.sgRNAtargetsitesandPAMsequencesareshowinredandbluelettersrespectively,thebaseCinpurpleofF0-5indicatedthesinglebaseinsert.


本文編號：3101221