第一部分骨質(zhì)疏松癥(OP)在世界范圍內(nèi)都是一種主要的公共衛(wèi)生問題,骨質(zhì)疏松性骨折(OF)因?yàn)楦咧職埪屎透咧滤缆实奶攸c(diǎn)被認(rèn)為是OP最嚴(yán)重的的結(jié)局。迄今,OP/OF的病理學(xué)機(jī)制仍然是未明的。骨密度(BMD)是被廣泛用來診斷OP的金標(biāo)準(zhǔn),外周血單核細(xì)胞(PBM)能分化形成破骨細(xì)胞并在骨表面附著吸收骨。近年來,差異表達(dá)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法被運(yùn)用來鑒定與疾病相關(guān)的蛋白標(biāo)志物。基于這個(gè)想法,我們?cè)O(shè)計(jì)了這項(xiàng)從中國老年男性PBM中鑒定OP潛在的蛋白標(biāo)志物并探究其分子機(jī)制的研究,該研究主要可以分成三章:第一章,基于定量蛋白質(zhì)組學(xué)Label-Free的方法,我們從中國老年男性的PBM樣本中系統(tǒng)地篩選OP潛在的蛋白標(biāo)志物;第二章,我們運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(WB)驗(yàn)證第一章質(zhì)譜方法篩選出的蛋白在PBM水平各組間的表達(dá)情況并觀察目的蛋白在血漿中的表達(dá)情況是否與樣本的髖部BMD相關(guān);第三章,我們通過體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察在不同濃度目的蛋白的培養(yǎng)條件下成骨細(xì)胞的活性變化。研究目的:運(yùn)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)Label-Free技術(shù),我們從中國老年男性的PBM樣本中系統(tǒng)地篩選潛在的OP蛋白標(biāo)志物;針對(duì)初步篩選出來的OP蛋白標(biāo)志物,我們運(yùn)用WB技術(shù)驗(yàn)證目的蛋白在男性的PBM樣本的各亞組間差異表達(dá)并觀察其在血漿樣本中的表達(dá)是否與樣本髖部BMD相關(guān);選出多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、證據(jù)充分的易感蛋白,通過體外實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度易感蛋白如何影響成骨細(xì)胞活性并探究易感蛋白與OP之間的分子功能機(jī)制。研究方法:我們招募了18個(gè)髖部OF(年齡均值77歲)的病人和18個(gè)年齡、性別匹配無骨折史的樣本(年齡均值73歲,簡寫為NF)構(gòu)成了男性PBM樣本。NF樣本是由一半極高BMD人群和一半極低BMD人群構(gòu)成的(髖部Z值:-1.06 vs.+1.36)。男性PBM樣本中所有的個(gè)體均為中國老年男性。另外一個(gè)獨(dú)立的女性PBM樣本是由27例髖部OF的病人(年齡均值78歲)和24例身高、年齡匹配的健康對(duì)照(年齡均值70歲)構(gòu)成的。女性PBM樣本中的NF對(duì)照也是由一半極高BMD人群和一半極低BMD人群構(gòu)成的(髖部Z值:-1.30 vs.+1.34)。女性PBM樣本中所有的個(gè)體為中國老年女性。PBM首先從外周血中分離,總蛋白也隨即從中獲得。全蛋白質(zhì)組學(xué)的蛋白表達(dá)譜通過Label-Free定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法獲得(Easy-n LC1000 and Q-exactive,Thermo)。蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)由Maxquant和Perseus軟件處理后獲得,我們按照表達(dá)倍數(shù)改變(fold change[FC])大于兩倍,P值小于0.05的標(biāo)準(zhǔn)分別從極端高、低骨密度組間和骨折、非骨折組間篩選鑒定出蛋白并定義為差異表達(dá)蛋白(DEP)。生物信息學(xué)分析,包括基因本體數(shù)據(jù)庫(GO)、京都基因和基因組百科全書(KEGG)、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)交互作用分析(PPI)被用來對(duì)DEP進(jìn)行功能注釋。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)中所有的研究樣本都是漢族的中國老年男性。首先,運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)血漿S100A9蛋白在20例OF病人和64例NF樣本的表達(dá)情況。64例NF樣本是由一半極低BMD人群和一半極高BMD人群構(gòu)成的(0.72±0.04 vs.1.12±0.05 g/cm2)。我們運(yùn)用t檢驗(yàn)的方法分別分析血漿S100A9蛋白在OF/NF組間和L/H組間表達(dá)差異。同樣我們運(yùn)用ELISA的方法初次檢測(cè)血漿ABI1蛋白在20例OF病人和64例NF樣本的表達(dá)情況。ABI1蛋白ELISA實(shí)驗(yàn)中所使用的20例OF病人與S100A9蛋白ELISA實(shí)驗(yàn)所涉及到的OF樣本是同一批,但是ABI1蛋白ELISA實(shí)驗(yàn)中所使用到的64例極端高低BMD樣本與S100A9的樣本有所區(qū)別(0.67±0.03 vs.1.18±0.06 g/cm2);第二次ABI1蛋白ELISA實(shí)驗(yàn)是在38例低BMD人群和37例高BMD人群中測(cè)試的(0.72±0.04 vs.1.11±0.04 g/cm2),血漿ABI1蛋白在OF/NF組間和L/H組間表達(dá)差異也是用相同的統(tǒng)計(jì)方法分析獲得的。此外,我們通過WB技術(shù)運(yùn)用目的蛋白特異性的抗體來觀察男性PBM樣本中PBM水平目的蛋白在各亞組間的表達(dá)差異。人類胎兒成骨細(xì)胞系(h FOB1.19)作為成骨細(xì)胞前體細(xì)胞,在嚴(yán)格的培養(yǎng)條件下能分化成為成熟的成骨細(xì)胞。我們?cè)趆 FOB的培養(yǎng)基中加入人類ABI1重組蛋白,形成0,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0ng/ml梯度的ABI1蛋白濃度。我們利用RTCA S16儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并記錄36小時(shí)內(nèi)h FOB細(xì)胞在不同濃度ABI1蛋白刺激下細(xì)胞指數(shù)(CI)的變化。我們運(yùn)用PE Annexin V凋亡試劑盒觀察ABI1蛋白刺激下h FOB細(xì)胞的凋亡。實(shí)時(shí)熒光定量PCR被用來觀察不同ABI1蛋白濃度刺激下成骨相關(guān)指標(biāo)堿性磷酸酶(ALP)、一型膠原蛋白A1(COL1A1)、骨橋蛋白(OPN)的表達(dá)水平。體外的ALP染色被用來觀察成骨細(xì)胞分化的活性。研究結(jié)果:我們?cè)诟叩凸敲芏冉M間共鑒定到15個(gè)DEPs,這些DEPs主要富集的生物過程有:“肌動(dòng)蛋白骨架組織”(P=0.004),“正調(diào)節(jié)Ⅰ-kapp B激酶/核因子-kappa B級(jí)聯(lián)”(P=0.005),“正調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞分化”(P=0.009),并且主要富集在趨化因子信號(hào)通路上(KEGG ID 04062)。此外,我們?cè)谀行訮BM樣本的骨折與非骨折樣本中鑒定到36個(gè)DEPs,這些DEPs主要富集的生物過程有:“生物附著”(P=4.38E-7),“細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性”(P=1.02E-6),“細(xì)胞遷移”(P=0.003),“趨化性”(P=0.007)。在男性PBM樣本中,ABI1蛋白在低骨密度組較高骨密度組表達(dá)下調(diào)(FC=0.82,P=0.043),相同的下調(diào)趨勢(shì)在OF樣本中也能觀察到(FC=0.73,P=0.008)。S100A9位于交互作用網(wǎng)絡(luò)的中央并與多個(gè)DEPs相互作用,該蛋白在低骨密度組較高骨密度組表達(dá)上調(diào)(FC=1.28,P=0.027),相同的上調(diào)趨勢(shì)在OF樣本中也能觀察到(FC=3.58,P=0.014)。ABI1和S100A9蛋白在女性PBM樣本各組間的表達(dá)調(diào)控趨勢(shì)與男性PBM樣本中基本相同。在PBM水平,S100A9蛋白在低BMD組較高BMD組表達(dá)上調(diào)(FC=1.28,P=0.027),OF組較NF組表達(dá)也是上調(diào)(FC=3.58,p=0.01)。但是該上調(diào)趨勢(shì)在血漿樣本中并沒有驗(yàn)證得到。在PBM水平,ABI1蛋白在低骨密度組較高骨密度組表達(dá)下調(diào)(FC=0.82,P=0.043),OF組較NF組表達(dá)也是下調(diào)(FC=0.73,P=0.007)。相同的下調(diào)趨勢(shì)在血漿水平的OF/NF組間(OF vs.NF:0.41 vs.1.03ng/ml,FC=0.39,P=0.039)和L/H(L vs.H:0.5 vs.1.57ng/ml,FC=0.39,P=0.0012)組間也觀察得到;再次獨(dú)立樣本ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證也能觀察到ABI1蛋白在低BMD組表達(dá)下調(diào)的趨勢(shì)L/H(L vs.H:0.86 vs.1.23ng/ml,FC=0.70,P=0.0036)。在WB實(shí)驗(yàn)中,校正了內(nèi)參GAPDH的表達(dá)量后,我們發(fā)現(xiàn)男性PBM樣本的PBM蛋白樣本中ABI1在OF和低骨密度組的表達(dá)較高骨密度組表達(dá)下調(diào)。與未加ABI1蛋白的空白對(duì)照組相比,不同濃度的ABI1蛋白均能促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長(0.5-4.0ng/ml),其中以2.0ng/ml濃度的促進(jìn)作用最為顯著,但是8.0ng/ml的濃度顯示過高并明顯地抑制了成骨細(xì)胞的生長。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)提示體外ABI1蛋白的刺激不會(huì)影響成骨細(xì)胞的凋亡。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,2.0ng/ml和0.5ng/ml的ABI1蛋白濃度,前者能明顯促進(jìn)成骨相關(guān)基因(ALP,COL1A1,OPN,P0.05)的表達(dá)水平;同時(shí)通過體外的ALP染色實(shí)驗(yàn)我們也發(fā)現(xiàn)2.0ng/ml和0.5ng/ml的ABI1蛋白濃度相比,前者的蛋白濃度刺激能明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的體外分化水平。研究結(jié)論:我們?cè)O(shè)計(jì)了此項(xiàng)研究嘗試從中國老年男性的PBM樣本中鑒定新的OP相關(guān)的標(biāo)志物,結(jié)果顯示ABI1蛋白通過調(diào)節(jié)成骨基因的表達(dá),影響成骨細(xì)胞的生長、分化和活性,從而影響人群的BMD值和OF,ABI1蛋白是OP潛在的蛋白標(biāo)志物。第二部分Anxa2抑制成骨細(xì)胞生長與中國老人髖骨密度和骨質(zhì)疏松性骨折相關(guān)研究目的:本研究目的在于1)觀察PBM樣本中Anxa2蛋白表達(dá)是否在OF病人與NF對(duì)照人群有顯著差異;2)觀察血漿Anxa2蛋白與髖部BMD是否相關(guān)3)觀察體外不同濃度的Anxa2蛋白刺激如何影響成骨細(xì)胞的活性。研究方法:所有的研究樣本均為中國漢族老年人。首先,我們運(yùn)用LC-MS/MS方法在45例OF病人和42例健康對(duì)照的PBM樣本中鑒定并定量Anxa2蛋白的表達(dá)。其次,我們運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)并比較血漿Anxa2蛋白在極端高、低骨密度樣本中的表達(dá)(0.63±0.10 vs.1.05±0.10 g/cm2,n=75)。我們開展了體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察Anxa2蛋白刺激對(duì)成骨細(xì)胞生長的影響。研究結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)PBM中Anxa2蛋白表達(dá)水平在OF病人組顯著高于NF對(duì)照組(FC=1.16,P0.05)。血漿Anxa2蛋白水平(31.69-227.35ng/ml)在極端低BMD人群中顯著高于極端高BMD人群(84.85 vs.66.15ng/ml,FC=1.28,P0.05)。成骨細(xì)胞生長動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)記錄證明Anxa2蛋白刺激作用呈現(xiàn)為濃度依賴的反U型曲線,具體表現(xiàn)為,低劑量的Anxa2蛋白能促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長,最適的刺激濃度為50ng/ml,但是過高的蛋白濃度(50ng/ml)會(huì)減弱成骨前體細(xì)胞h FOB1.19的生長。研究結(jié)論:Anxa2蛋白減弱成骨細(xì)胞的生長且與中國老年人的髖部BMD和OF相關(guān)。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R580
【部分圖文】：

樣本量與檢驗(yàn)效能關(guān)系圖

Maxquant軟件進(jìn)行非標(biāo)記定量的原理

非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)（Maxquant）流程
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