第一部分骨質(zhì)疏松癥(OP)在世界范圍內(nèi)都是一種主要的公共衛(wèi)生問題,骨質(zhì)疏松性骨折(OF)因為高致殘率和高致死率的特點被認為是OP最嚴重的的結(jié)局。迄今,OP/OF的病理學(xué)機制仍然是未明的。骨密度(BMD)是被廣泛用來診斷OP的金標準,外周血單核細胞(PBM)能分化形成破骨細胞并在骨表面附著吸收骨。近年來,差異表達的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法被運用來鑒定與疾病相關(guān)的蛋白標志物�；谶@個想法,我們設(shè)計了這項從中國老年男性PBM中鑒定OP潛在的蛋白標志物并探究其分子機制的研究,該研究主要可以分成三章:第一章,基于定量蛋白質(zhì)組學(xué)Label-Free的方法,我們從中國老年男性的PBM樣本中系統(tǒng)地篩選OP潛在的蛋白標志物;第二章,我們運用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(WB)驗證第一章質(zhì)譜方法篩選出的蛋白在PBM水平各組間的表達情況并觀察目的蛋白在血漿中的表達情況是否與樣本的髖部BMD相關(guān);第三章,我們通過體外的細胞實驗觀察在不同濃度目的蛋白的培養(yǎng)條件下成骨細胞的活性變化。研究目的:運用定量蛋白質(zhì)組學(xué)Label-Free技術(shù),我們從中國老年男性的PBM樣本中系統(tǒng)地篩選潛在的OP蛋白標志物;針對初步篩選出來的OP蛋白標志物,我們運用WB技術(shù)驗證目的蛋白在男性的PBM樣本的各亞組間差異表達并觀察其在血漿樣本中的表達是否與樣本髖部BMD相關(guān);選出多次實驗驗證、證據(jù)充分的易感蛋白,通過體外實驗觀察不同濃度易感蛋白如何影響成骨細胞活性并探究易感蛋白與OP之間的分子功能機制。研究方法:我們招募了18個髖部OF(年齡均值77歲)的病人和18個年齡、性別匹配無骨折史的樣本(年齡均值73歲,簡寫為NF)構(gòu)成了男性PBM樣本。NF樣本是由一半極高BMD人群和一半極低BMD人群構(gòu)成的(髖部Z值:-1.06 vs.+1.36)。男性PBM樣本中所有的個體均為中國老年男性。另外一個獨立的女性PBM樣本是由27例髖部OF的病人(年齡均值78歲)和24例身高、年齡匹配的健康對照(年齡均值70歲)構(gòu)成的。女性PBM樣本中的NF對照也是由一半極高BMD人群和一半極低BMD人群構(gòu)成的(髖部Z值:-1.30 vs.+1.34)。女性PBM樣本中所有的個體為中國老年女性。PBM首先從外周血中分離,總蛋白也隨即從中獲得。全蛋白質(zhì)組學(xué)的蛋白表達譜通過Label-Free定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法獲得(Easy-n LC1000 and Q-exactive,Thermo)。蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)由Maxquant和Perseus軟件處理后獲得,我們按照表達倍數(shù)改變(fold change[FC])大于兩倍,P值小于0.05的標準分別從極端高、低骨密度組間和骨折、非骨折組間篩選鑒定出蛋白并定義為差異表達蛋白(DEP)。生物信息學(xué)分析,包括基因本體數(shù)據(jù)庫(GO)、京都基因和基因組百科全書(KEGG)、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)交互作用分析(PPI)被用來對DEP進行功能注釋。酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)中所有的研究樣本都是漢族的中國老年男性。首先,運用ELISA方法檢測血漿S100A9蛋白在20例OF病人和64例NF樣本的表達情況。64例NF樣本是由一半極低BMD人群和一半極高BMD人群構(gòu)成的(0.72±0.04 vs.1.12±0.05 g/cm2)。我們運用t檢驗的方法分別分析血漿S100A9蛋白在OF/NF組間和L/H組間表達差異。同樣我們運用ELISA的方法初次檢測血漿ABI1蛋白在20例OF病人和64例NF樣本的表達情況。ABI1蛋白ELISA實驗中所使用的20例OF病人與S100A9蛋白ELISA實驗所涉及到的OF樣本是同一批,但是ABI1蛋白ELISA實驗中所使用到的64例極端高低BMD樣本與S100A9的樣本有所區(qū)別(0.67±0.03 vs.1.18±0.06 g/cm2);第二次ABI1蛋白ELISA實驗是在38例低BMD人群和37例高BMD人群中測試的(0.72±0.04 vs.1.11±0.04 g/cm2),血漿ABI1蛋白在OF/NF組間和L/H組間表達差異也是用相同的統(tǒng)計方法分析獲得的。此外,我們通過WB技術(shù)運用目的蛋白特異性的抗體來觀察男性PBM樣本中PBM水平目的蛋白在各亞組間的表達差異。人類胎兒成骨細胞系(h FOB1.19)作為成骨細胞前體細胞,在嚴格的培養(yǎng)條件下能分化成為成熟的成骨細胞。我們在h FOB的培養(yǎng)基中加入人類ABI1重組蛋白,形成0,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0ng/ml梯度的ABI1蛋白濃度。我們利用RTCA S16儀器實時監(jiān)測并記錄36小時內(nèi)h FOB細胞在不同濃度ABI1蛋白刺激下細胞指數(shù)(CI)的變化。我們運用PE Annexin V凋亡試劑盒觀察ABI1蛋白刺激下h FOB細胞的凋亡。實時熒光定量PCR被用來觀察不同ABI1蛋白濃度刺激下成骨相關(guān)指標堿性磷酸酶(ALP)、一型膠原蛋白A1(COL1A1)、骨橋蛋白(OPN)的表達水平。體外的ALP染色被用來觀察成骨細胞分化的活性。研究結(jié)果:我們在高低骨密度組間共鑒定到15個DEPs,這些DEPs主要富集的生物過程有:“肌動蛋白骨架組織”(P=0.004),“正調(diào)節(jié)Ⅰ-kapp B激酶/核因子-kappa B級聯(lián)”(P=0.005),“正調(diào)節(jié)肥大細胞分化”(P=0.009),并且主要富集在趨化因子信號通路上(KEGG ID 04062)。此外,我們在男性PBM樣本的骨折與非骨折樣本中鑒定到36個DEPs,這些DEPs主要富集的生物過程有:“生物附著”(P=4.38E-7),“細胞運動性”(P=1.02E-6),“細胞遷移”(P=0.003),“趨化性”(P=0.007)。在男性PBM樣本中,ABI1蛋白在低骨密度組較高骨密度組表達下調(diào)(FC=0.82,P=0.043),相同的下調(diào)趨勢在OF樣本中也能觀察到(FC=0.73,P=0.008)。S100A9位于交互作用網(wǎng)絡(luò)的中央并與多個DEPs相互作用,該蛋白在低骨密度組較高骨密度組表達上調(diào)(FC=1.28,P=0.027),相同的上調(diào)趨勢在OF樣本中也能觀察到(FC=3.58,P=0.014)。ABI1和S100A9蛋白在女性PBM樣本各組間的表達調(diào)控趨勢與男性PBM樣本中基本相同。在PBM水平,S100A9蛋白在低BMD組較高BMD組表達上調(diào)(FC=1.28,P=0.027),OF組較NF組表達也是上調(diào)(FC=3.58,p=0.01)。但是該上調(diào)趨勢在血漿樣本中并沒有驗證得到。在PBM水平,ABI1蛋白在低骨密度組較高骨密度組表達下調(diào)(FC=0.82,P=0.043),OF組較NF組表達也是下調(diào)(FC=0.73,P=0.007)。相同的下調(diào)趨勢在血漿水平的OF/NF組間(OF vs.NF:0.41 vs.1.03ng/ml,FC=0.39,P=0.039)和L/H(L vs.H:0.5 vs.1.57ng/ml,FC=0.39,P=0.0012)組間也觀察得到;再次獨立樣本ELISA實驗驗證也能觀察到ABI1蛋白在低BMD組表達下調(diào)的趨勢L/H(L vs.H:0.86 vs.1.23ng/ml,FC=0.70,P=0.0036)。在WB實驗中,校正了內(nèi)參GAPDH的表達量后,我們發(fā)現(xiàn)男性PBM樣本的PBM蛋白樣本中ABI1在OF和低骨密度組的表達較高骨密度組表達下調(diào)。與未加ABI1蛋白的空白對照組相比,不同濃度的ABI1蛋白均能促進成骨細胞的生長(0.5-4.0ng/ml),其中以2.0ng/ml濃度的促進作用最為顯著,但是8.0ng/ml的濃度顯示過高并明顯地抑制了成骨細胞的生長。細胞凋亡實驗提示體外ABI1蛋白的刺激不會影響成骨細胞的凋亡。實時熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示,2.0ng/ml和0.5ng/ml的ABI1蛋白濃度,前者能明顯促進成骨相關(guān)基因(ALP,COL1A1,OPN,P0.05)的表達水平;同時通過體外的ALP染色實驗我們也發(fā)現(xiàn)2.0ng/ml和0.5ng/ml的ABI1蛋白濃度相比,前者的蛋白濃度刺激能明顯促進成骨細胞的體外分化水平。研究結(jié)論:我們設(shè)計了此項研究嘗試從中國老年男性的PBM樣本中鑒定新的OP相關(guān)的標志物,結(jié)果顯示ABI1蛋白通過調(diào)節(jié)成骨基因的表達,影響成骨細胞的生長、分化和活性,從而影響人群的BMD值和OF,ABI1蛋白是OP潛在的蛋白標志物。第二部分Anxa2抑制成骨細胞生長與中國老人髖骨密度和骨質(zhì)疏松性骨折相關(guān)研究目的:本研究目的在于1)觀察PBM樣本中Anxa2蛋白表達是否在OF病人與NF對照人群有顯著差異;2)觀察血漿Anxa2蛋白與髖部BMD是否相關(guān)3)觀察體外不同濃度的Anxa2蛋白刺激如何影響成骨細胞的活性。研究方法:所有的研究樣本均為中國漢族老年人。首先,我們運用LC-MS/MS方法在45例OF病人和42例健康對照的PBM樣本中鑒定并定量Anxa2蛋白的表達。其次,我們運用ELISA方法檢測并比較血漿Anxa2蛋白在極端高、低骨密度樣本中的表達(0.63±0.10 vs.1.05±0.10 g/cm2,n=75)。我們開展了體外的細胞實驗觀察Anxa2蛋白刺激對成骨細胞生長的影響。研究結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)PBM中Anxa2蛋白表達水平在OF病人組顯著高于NF對照組(FC=1.16,P0.05)。血漿Anxa2蛋白水平(31.69-227.35ng/ml)在極端低BMD人群中顯著高于極端高BMD人群(84.85 vs.66.15ng/ml,FC=1.28,P0.05)。成骨細胞生長動態(tài)監(jiān)測記錄證明Anxa2蛋白刺激作用呈現(xiàn)為濃度依賴的反U型曲線,具體表現(xiàn)為,低劑量的Anxa2蛋白能促進成骨細胞的生長,最適的刺激濃度為50ng/ml,但是過高的蛋白濃度(50ng/ml)會減弱成骨前體細胞h FOB1.19的生長。研究結(jié)論:Anxa2蛋白減弱成骨細胞的生長且與中國老年人的髖部BMD和OF相關(guān)。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R580
【部分圖文】：

樣本量與檢驗效能關(guān)系圖

Maxquant軟件進行非標記定量的原理

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本文編號：2883864