脆性 X 染色體綜合征(Fragile X mental retardation Syndrome,FXS)是一種最常見的遺傳性精神發(fā)育遲滯疾病。FXS在男性中發(fā)病率為1/4000,女性中發(fā)病率為1/6000。其主要癥狀表現(xiàn)為認知和行為缺陷、智力低下、語言學(xué)習(xí)和交流障礙,長臉、大耳、睪丸巨大。部分病人表現(xiàn)出自閉癥(autism)的癥狀。FXS的發(fā)病原因是位于位于X染色體上Xq27位點的基因Fmrl(Fragile X mental retardation gene 1)的5'端非編碼區(qū)出現(xiàn)多于200 bp CGG三核苷酸重復(fù)性突變,相鄰的CpG島高甲基化,導(dǎo)致Fmrl基因表達關(guān)閉和編碼蛋白FMRP缺失。FXS的病理改變主要是大腦皮層神經(jīng)元的樹突棘密度增加,形態(tài)更為細長和彎曲,缺少成熟的蘑菇樣樹突棘。由FXS導(dǎo)致的智力障礙給病人帶來巨大的痛苦,患者從出生到生命結(jié)束這一漫長的病程給家庭和社會帶來極其沉重的負擔(dān)。目前僅有少數(shù)幾種藥物可用于改善部分癥狀。雖然有多種小分子化合物進入臨床試驗,但結(jié)果并不理想,其核心癥狀依然無藥可治。大量研究表明在FXS病人外周組織和Fmrl KO小鼠神經(jīng)元中多種激酶所介導(dǎo)的細胞磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能紊亂。FMRP蛋白的缺失引起神經(jīng)元多種激酶信號通路異常,而且多表現(xiàn)在磷酸化水平的增加。此外,FMRP可能參與DNA損傷修復(fù),有報導(dǎo)Fmrl敲除促進精母細胞的凋亡。FMRP是一個mRNA結(jié)合蛋白,主要起翻譯抑制作用(調(diào)控新蛋白合成)。在基因組和轉(zhuǎn)錄組的水平利用Fmrl KO小鼠對FMRP結(jié)合哪些mRNA,調(diào)控哪些mRNA的翻譯,維持哪些mRNA的穩(wěn)定性有過—系列的研究。發(fā)現(xiàn)FMRP主要結(jié)合在接近900個靶點蛋白mRNA的編碼區(qū)。這些蛋白質(zhì)包括突觸前、后蛋白和與自閉癥候群相關(guān)的蛋白,提示FXS發(fā)病與調(diào)控突觸蛋白翻譯緊密相關(guān)。研究蛋白質(zhì)的翻譯(即蛋白質(zhì)合成)可能為揭示FXS病理機制提供幫助。液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用為基礎(chǔ)的蛋白組學(xué)技術(shù)將復(fù)雜的組織、細胞蛋白提取物利用胰酶降解為多肽復(fù)合物,再用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用/二級質(zhì)譜分析的方法得到多肽的二級譜圖,結(jié)合完備的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫解析多肽序列,進而大規(guī)模地鑒定特異蛋白質(zhì)。本實驗收集了 Fmrl野生型和敲除小鼠大腦皮層,利用基于超濾輔助的樣品制備方法,結(jié)合串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記方法和高pH的反向色譜分離,結(jié)合高壓液相色譜質(zhì)譜連用分析獲得大規(guī)模的定量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)。同時再利用二氧化鈦納米顆粒富集磷酸化多肽并用Motif X數(shù)據(jù)庫預(yù)測了磷酸化位點的特征。利用磷酸化特異性抗體和靶向質(zhì)譜的手段對結(jié)果進行驗證,構(gòu)建模擬磷酸化和模擬磷酸化缺失的突變體導(dǎo)入Hela細胞和神經(jīng)細胞系中,用激光共聚焦顯微鏡觀察其定位情況。再引入誘導(dǎo)凋亡的脅迫處理,分析應(yīng)激條件下磷酸化的作用。FMRP通過結(jié)合靶蛋白mRNA進而調(diào)控蛋白質(zhì)的合成。本實驗利用甲硫氨酸類似物疊氮同型丙氨酸(AHA)標(biāo)記新合成蛋白質(zhì),用基于疊氮-炔反應(yīng)的化學(xué)生物學(xué)方法直接富集新蛋白質(zhì),再用質(zhì)譜檢測并定量新合成的蛋白質(zhì)。本實驗結(jié)果表明小鼠大腦皮層中,共鑒定了 4927個蛋白,上調(diào)蛋白56個,下調(diào)蛋白36個。這些差異表達蛋白主要富集突觸上,主要與RNA結(jié)合、細胞器組裝及細胞壓力調(diào)節(jié)等通路相關(guān)。磷酸化水平上,共鑒定磷酸化位點7696個,其中上調(diào)139個,下調(diào)2個,這些差異磷酸化位點主要富集在細胞骨架蛋白結(jié)合、actin結(jié)合等通路上。通過Motif-X分析歸納出...SP...,..TP...,..RxxS..等基序。我們優(yōu)化了靶向質(zhì)譜的方法,驗證了其準(zhǔn)確度和重復(fù)性,在此基礎(chǔ)上驗證了蛋白質(zhì)組部分蛋白上調(diào)的結(jié)果。PRKRA模擬磷酸化和模擬磷酸化缺失突變體在基態(tài)下不影響其定位,并且與FMRP有共定位。壓力脅迫下,PRKRA模擬磷酸化突變體促進細胞凋亡,PRKRA模擬磷酸化缺失突變體減少細胞凋亡。甲硫氨酸類似物疊氮同型丙氨酸(AHA)可以用于標(biāo)記新合成蛋白質(zhì),鑒定到新合成蛋白。這些新合成有差異的蛋白可能是FMRP的潛在靶蛋白。綜上,本研究大規(guī)模定量分析了 Fmrl敲除小鼠大腦皮層蛋白質(zhì)組和磷酸化組的變化,并驗證了其中部分結(jié)果。構(gòu)建了模擬磷酸化和磷酸化缺失的突變體,發(fā)現(xiàn)PRKRAS18磷酸化促進細胞凋亡,PRKRAS18A減少細胞凋亡。針對FMRP調(diào)控蛋白質(zhì)合成的特點,開發(fā)了非天然氨基酸參入,靶向富集新合成蛋白的方案,成功富集到新合成蛋白。這些成果擴大了對FXS疾病的認知程度,為FXS疾病提供了潛在的分子靶標(biāo),并為其治療提供了一定的依據(jù)。
【學(xué)位單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R596.1
【部分圖文】：

圖 1-1 FMR1 基因第一號外顯子的 CGG 重復(fù)序列數(shù)目與疾病相關(guān)性[8]正常人有 6 到 50 個 CGG 重復(fù)，并且是非甲基化的。脆性 X 攜帶者有 50 到 200 個 CGG 重復(fù)序列，并且是非甲基化的，F(xiàn)MRP 蛋白有表達。脆性 X 染色體綜合征患者有大于 200 個 CGG 重復(fù)序列，并且是甲基化的，F(xiàn)MRP 蛋白表達降低。1.2 FMRP 蛋白1.2.1 FMRP 蛋白結(jié)構(gòu)FMRP 蛋白包含 N 端結(jié)構(gòu)域、KH1、KH2 結(jié)構(gòu)域和 C 端結(jié)構(gòu)域。其中 N 端結(jié)構(gòu)域上包含核定位信號 NLS。KH 結(jié)構(gòu)域負責(zé)結(jié)合 RNA，其中 KH2 結(jié)構(gòu)域上第

圖 1-2 FMRP 蛋白結(jié)構(gòu) [8]FMRP 是一個 RNA 結(jié)合蛋白，純化的的 FMRP 具有結(jié)合 RNA 的能力[9]。核糖體與蛋白形成 FMRP-mRNP 復(fù)合體。有假說認為，當(dāng) FMRP 缺失的時候，正處于 FMRP-mRNP 復(fù)合體中的 mRNA 翻譯會受到影響，繼而導(dǎo)致認知缺陷[10]。為了鑒定與內(nèi)源性的 FMRP 有相互作用的 mRNA，首先開發(fā)了一款特異的針對FMRP 蛋白的抗體，流程是用鼠的 FMRP 蛋白免疫 FMRP 敲除的小鼠。得到的抗體分別用于免疫沉 WT 和 KO 的小鼠腦裂解液，IP 下來的 mRNA 經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用芯片雜交。 該芯片包含了 UniGene 數(shù)據(jù)庫的 19,201 個 mRNA，并用 RT-PCR 驗證了芯片的結(jié)果。此后，又開發(fā)了基于光交聯(lián)的方法[11]。FMRP亞型 1 和亞型 7 結(jié)合了大約 80,000 個位點，其中超過 85%的位點能夠覆蓋到約6,000 個 mRNA。FXR1P 和 FXR2P 蛋白的結(jié)合位點與 FMRP 的結(jié)合位點相比較，

華東師范大學(xué)博士學(xué)位論文1.5 蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的最初目標(biāo)是鑒定蛋白質(zhì)。其中應(yīng)用最廣泛的方法是“自底向上”的策略�；玖鞒淌怯妹笇⒌鞍讟悠贩纸獬啥嚯幕旌衔铩６嚯慕�(jīng)過分離后，在離子源發(fā)生電離帶上電荷，進入質(zhì)譜后，質(zhì)譜儀記錄質(zhì)量電荷比和時間。采集后的數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)處理，得到結(jié)果[35]。
【共引文獻】

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本文編號：2837580