發(fā)布時(shí)間：2020-09-18 18:51

　　 糖尿病是一種代謝類疾病,又稱高血糖癥,表現(xiàn)為多食、多尿、多飲、體重減少。長(zhǎng)期的高血糖引起機(jī)體多個(gè)組織器官的損傷,尤其是眼、腎、心臟、血管和神經(jīng)等的功能障礙。胰島β細(xì)胞損傷是糖尿病的癥結(jié)所在。豬的胰腺干細(xì)胞(Pocine Pancretic Stem Cells,pPSCs)是從胎豬胰腺中分離出來(lái)的一種成體干細(xì)胞,在細(xì)胞中轉(zhuǎn)入大T載體形成永生化細(xì)胞系,實(shí)驗(yàn)室先前的研究證明該細(xì)胞經(jīng)化學(xué)小分子誘導(dǎo)可分化為胰島素分泌細(xì)胞。又因豬的基因組以及胰島素的結(jié)構(gòu)與人的相似性,所以研究pPSCs對(duì)未來(lái)糖尿病的臨床治療具有深遠(yuǎn)的意義。SerpinB1是一種蛋白酶抑制劑,通過(guò)抑制蛋白酶活性緩解由炎性反應(yīng)所引起的組織損傷。有研究表明,肝的胰島素抵抗促進(jìn)了SerpinB1的分泌,作用于胰腺促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖,并且這一反應(yīng)與其蛋白酶抑制劑活性相關(guān)。干細(xì)胞的自我更新和分化受到機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞因子的調(diào)控,胰腺干細(xì)胞作為一種成體干細(xì)胞,SerpinB1對(duì)成體干細(xì)胞-豬胰腺干細(xì)胞的影響目前仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)探究了SerpinB1對(duì)pPSCs中影響及作用機(jī)理。通過(guò)超表達(dá)和干擾pPSCs中SerpinB1的表達(dá),一方面證實(shí)超表達(dá)SerpinB1可以促進(jìn)pPSCs的增殖,另一方面發(fā)現(xiàn)SerpinB1在pPSCs誘導(dǎo)分化后期表達(dá)量增加,干擾SerpinB1影響了pPSCs的誘導(dǎo)分化效率,不利于胰島素分泌細(xì)胞的形成。本實(shí)驗(yàn)為pPSCs的增殖機(jī)制提供了理論依據(jù),另外為體外高效的獲得胰島素分泌細(xì)胞提供了新的思路和手段。1.SerpinB1促進(jìn)pPSCs的增殖首先,通過(guò)運(yùn)用qRT-PCR(實(shí)時(shí)熒光定量)對(duì)pPSCs中的SerpinB1的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),SerpinB1在pPSCs中大量表達(dá)。隨后一方面運(yùn)用shRNA干擾SerpinB1在細(xì)胞中的表達(dá),另一方面使細(xì)胞超表達(dá)SerpinB1。通過(guò)CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)干擾SerpinB1使細(xì)胞的活性降低,超表達(dá)SerpinB1增強(qiáng)了細(xì)胞活性。隨后的EdU、流式細(xì)胞術(shù)周期檢測(cè)以及qRT-PCR結(jié)果顯示,與正常的細(xì)胞相比,干擾SerpinB1后細(xì)胞的EdU陽(yáng)性率明顯降低,處于S期的細(xì)胞比率下降,并且細(xì)胞中CDK2、PCNA以及CyclinD1的mRNA表達(dá)水平顯著降低,說(shuō)明SerpinB1促進(jìn)pPSCs進(jìn)入S期而促進(jìn)pPSCs的增殖。Western blotting檢測(cè)蛋白水平結(jié)果顯示,超表達(dá)SerpinB1激活了STAT3、CDK2、和CyclinD1蛋白水平的表達(dá),抑制了P53和P21的表達(dá)。所以我們推測(cè)SerpinB1通過(guò)STAT3信號(hào)通路促進(jìn)pPSCs的增殖。2.SerpinB1促進(jìn)pPSCs誘導(dǎo)分化成胰島素分泌細(xì)胞首先,我們運(yùn)用兩步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)pPSCs形成胰島素分泌細(xì)胞,qRT-PCR和Western blotting的檢測(cè)結(jié)果顯示胰島素分泌細(xì)胞中SerpinB1的表達(dá)水平顯著升高。隨后分別在誘導(dǎo)1d、3d、9d取樣進(jìn)行Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),SerpinB1在整個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程中的表達(dá)逐漸升高。其后,分別對(duì)干擾和超表達(dá)SerpinB1的pPSCs進(jìn)行誘導(dǎo),與對(duì)照組相比,發(fā)現(xiàn)干擾SerpinB1的表達(dá)后,誘導(dǎo)形成的胰島素分泌細(xì)胞在懸浮誘導(dǎo)培養(yǎng)基中聚團(tuán)松散不致密,培養(yǎng)基中存在大量懸浮的零散細(xì)胞,聚團(tuán)后的細(xì)胞不易貼壁,細(xì)胞遷出率低,DTZ和Insulin染色顯色不明顯,在mRNA水平低表達(dá)Insulin、NeuroD、PDX1、Glut-2、Nkx6.1和MafA,并且ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),高糖刺激反應(yīng)不靈敏。超表達(dá)SerpinB1后,在mRNA水平,Insulin、NeuroD、PDX1、Glut-2、Nkx6.1和MafA的表達(dá)明顯升高,胰島素分泌量顯著性的增加。據(jù)此我們推測(cè),SerpinB1影響了pPSCs向胰島素分泌細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R587.1
【部分圖文】：

圖 1-1 1 型糖尿病的發(fā)病過(guò)程(Katsarou et al. 2017)Fig 1-1 Staging of Type 1 Diabetes(Katsarou et al. 2017)2 型糖尿病又稱“非胰島素依賴型糖尿病”或“成人型糖尿病”，占糖尿病患病總0%-95%。2 型糖尿病的發(fā)生常與肥胖有關(guān)，有研究表明，肥胖會(huì)引起肝臟或者胰島素耐受，長(zhǎng)期的胰島素耐受以及后期的胰島素分泌不足將導(dǎo)致機(jī)體代謝紊血液中的葡萄糖和脂質(zhì)的含量增加 (Jensen et al. 2013)。胰島素耐受是由多種因，誘因包括：脂質(zhì)等代謝燃料的過(guò)量積累、炎性反應(yīng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 (Ferrannini et al. 2013)。胰島素耐受主要發(fā)生在肝臟、骨骼肌和脂肪細(xì)胞 3 個(gè)部位。在肝臟的脂肪酸或者葡萄糖使脂肪酸的代謝脫離線粒體的氧化途徑，轉(zhuǎn)而進(jìn)行酯化途大量的脂質(zhì)，進(jìn)而激活絲氨酸激酶，磷酸化胰島素受體，使胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分最后肝臟產(chǎn)生胰島素耐受。而在骨骼肌細(xì)胞中，過(guò)量的脂肪酸造成脂肪酸的非，未完全氧化的脂質(zhì)積累在線粒體內(nèi)，產(chǎn)生大量的自由基，進(jìn)而引發(fā)肌細(xì)胞的，激活絲氨酸激酶阻礙胰島素信號(hào)的傳導(dǎo)而引起骨骼肌的胰島素耐受 (Jensen )。2 型糖尿病另外一個(gè)病理特征是 β 細(xì)胞的損傷，過(guò)多的營(yíng)養(yǎng)攝入需要胰島合胰島素，大量的胰島素合成增加了 β 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)擔(dān)，引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激使

受到胰腺或者胰島供體不足以及長(zhǎng)期使用免疫抑制劑的限制 (Shapiro et al. 2016)。來(lái)，細(xì)胞療法成為治療糖尿病的一種新方法，通過(guò)促進(jìn) β 細(xì)胞的再生而獲得功能成β 細(xì)胞已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。1.2.2 獲得功能 β 胞的方法1.2.2.1 誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成 β 樣細(xì)胞由于干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的潛能，誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞（ESCs）或者成細(xì)胞分化、獲得功能成熟的 β 細(xì)胞成為體外獲得大量 β 細(xì)胞的方法，打破了 β 細(xì)胞供體不足對(duì)糖尿病臨床治療的限制。我們知道，胰腺是由內(nèi)胚層發(fā)育而來(lái)的，在胚育過(guò)程中，ESCs 在 TGF-β、activin、Wnt 和(PI(3)K)-AKT 等信號(hào)通路的作用下，定化成內(nèi)胚層 (D'Amour et al. 2005; D'Amour et al. 2006; Kubo et al. 2004; Mclean e2007; Stainier 2002)。隨后在維甲酸、BMP（骨形態(tài)發(fā)生蛋白）以及 Hedgehog 的作用發(fā)育成 PDX1+胰腺祖細(xì)胞 (Diiorio et al. 2002; Roy et al. 2001; Stafford and Prince 2Tiso et al. 2002)。隨后 FGF10 激活 Notch 信號(hào)通路調(diào)控胰腺祖細(xì)胞向胰腺導(dǎo)管細(xì)胞分泌細(xì)胞和外分泌細(xì)胞發(fā)育 (Bhushan et al. 2001; Hart et al. 2003)。

圖 1-3 促進(jìn) β 細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子(Tarasov and Rorsma 1-3 β-Cell Proliferation Is Stimulated by Circulating Factors(T1 與 STAT3 信號(hào)通路1 概述1 是絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serpins）超家族的一員。上，Serpins 是由單體蛋白組成的超家族，大小范分支，每個(gè)分支包含 3-77個(gè)成員 (Silverman et al., 2一員，被稱為單核-嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑，抑制多種蛋白酶的活性，如嗜中性彈性蛋白酶，a et al. 2002; Cooley et al. 2001)。1 的研究進(jìn)展1 通過(guò)抑制蛋白酶的活性來(lái)調(diào)控炎癥反應(yīng) (Silverm SerpinB1 與免疫性疾病、癌癥以及糖尿病發(fā)生的

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 楚元奎;曹暉;王峗;張翊華;竇忠英;;胎豬胰腺干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞及其移植治療裸鼠糖尿病的研究[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2011年01期

2 蔣澤生;高毅;慕寧;;共培養(yǎng)誘導(dǎo)人骨髓多能成體祖細(xì)胞分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2007年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 楚元奎;胎豬胰島間充質(zhì)干細(xì)胞分離鑒定及向胰島素分泌細(xì)胞分化的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2822036