糖尿病是一種代謝類疾病,又稱高血糖癥,表現(xiàn)為多食、多尿、多飲、體重減少。長期的高血糖引起機體多個組織器官的損傷,尤其是眼、腎、心臟、血管和神經(jīng)等的功能障礙。胰島β細胞損傷是糖尿病的癥結(jié)所在。豬的胰腺干細胞(Pocine Pancretic Stem Cells,pPSCs)是從胎豬胰腺中分離出來的一種成體干細胞,在細胞中轉(zhuǎn)入大T載體形成永生化細胞系,實驗室先前的研究證明該細胞經(jīng)化學(xué)小分子誘導(dǎo)可分化為胰島素分泌細胞。又因豬的基因組以及胰島素的結(jié)構(gòu)與人的相似性,所以研究pPSCs對未來糖尿病的臨床治療具有深遠的意義。SerpinB1是一種蛋白酶抑制劑,通過抑制蛋白酶活性緩解由炎性反應(yīng)所引起的組織損傷。有研究表明,肝的胰島素抵抗促進了SerpinB1的分泌,作用于胰腺促進胰島β細胞的增殖,并且這一反應(yīng)與其蛋白酶抑制劑活性相關(guān)。干細胞的自我更新和分化受到機體內(nèi)多種細胞因子的調(diào)控,胰腺干細胞作為一種成體干細胞,SerpinB1對成體干細胞-豬胰腺干細胞的影響目前仍不清楚。本實驗探究了SerpinB1對pPSCs中影響及作用機理。通過超表達和干擾pPSCs中SerpinB1的表達,一方面證實超表達SerpinB1可以促進pPSCs的增殖,另一方面發(fā)現(xiàn)SerpinB1在pPSCs誘導(dǎo)分化后期表達量增加,干擾SerpinB1影響了pPSCs的誘導(dǎo)分化效率,不利于胰島素分泌細胞的形成。本實驗為pPSCs的增殖機制提供了理論依據(jù),另外為體外高效的獲得胰島素分泌細胞提供了新的思路和手段。1.SerpinB1促進pPSCs的增殖首先,通過運用qRT-PCR(實時熒光定量)對pPSCs中的SerpinB1的mRNA水平進行檢測發(fā)現(xiàn),SerpinB1在pPSCs中大量表達。隨后一方面運用shRNA干擾SerpinB1在細胞中的表達,另一方面使細胞超表達SerpinB1。通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)干擾SerpinB1使細胞的活性降低,超表達SerpinB1增強了細胞活性。隨后的EdU、流式細胞術(shù)周期檢測以及qRT-PCR結(jié)果顯示,與正常的細胞相比,干擾SerpinB1后細胞的EdU陽性率明顯降低,處于S期的細胞比率下降,并且細胞中CDK2、PCNA以及CyclinD1的mRNA表達水平顯著降低,說明SerpinB1促進pPSCs進入S期而促進pPSCs的增殖。Western blotting檢測蛋白水平結(jié)果顯示,超表達SerpinB1激活了STAT3、CDK2、和CyclinD1蛋白水平的表達,抑制了P53和P21的表達。所以我們推測SerpinB1通過STAT3信號通路促進pPSCs的增殖。2.SerpinB1促進pPSCs誘導(dǎo)分化成胰島素分泌細胞首先,我們運用兩步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)pPSCs形成胰島素分泌細胞,qRT-PCR和Western blotting的檢測結(jié)果顯示胰島素分泌細胞中SerpinB1的表達水平顯著升高。隨后分別在誘導(dǎo)1d、3d、9d取樣進行Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),SerpinB1在整個誘導(dǎo)過程中的表達逐漸升高。其后,分別對干擾和超表達SerpinB1的pPSCs進行誘導(dǎo),與對照組相比,發(fā)現(xiàn)干擾SerpinB1的表達后,誘導(dǎo)形成的胰島素分泌細胞在懸浮誘導(dǎo)培養(yǎng)基中聚團松散不致密,培養(yǎng)基中存在大量懸浮的零散細胞,聚團后的細胞不易貼壁,細胞遷出率低,DTZ和Insulin染色顯色不明顯,在mRNA水平低表達Insulin、NeuroD、PDX1、Glut-2、Nkx6.1和MafA,并且ELISA檢測發(fā)現(xiàn),高糖刺激反應(yīng)不靈敏。超表達SerpinB1后,在mRNA水平,Insulin、NeuroD、PDX1、Glut-2、Nkx6.1和MafA的表達明顯升高,胰島素分泌量顯著性的增加。據(jù)此我們推測,SerpinB1影響了pPSCs向胰島素分泌細胞的誘導(dǎo)效率。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R587.1
【部分圖文】：

圖 1-1 1 型糖尿病的發(fā)病過程(Katsarou et al. 2017)Fig 1-1 Staging of Type 1 Diabetes(Katsarou et al. 2017)2 型糖尿病又稱“非胰島素依賴型糖尿病”或“成人型糖尿病”，占糖尿病患病總0%-95%。2 型糖尿病的發(fā)生常與肥胖有關(guān)，有研究表明，肥胖會引起肝臟或者胰島素耐受，長期的胰島素耐受以及后期的胰島素分泌不足將導(dǎo)致機體代謝紊血液中的葡萄糖和脂質(zhì)的含量增加 (Jensen et al. 2013)。胰島素耐受是由多種因，誘因包括：脂質(zhì)等代謝燃料的過量積累、炎性反應(yīng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 (Ferrannini et al. 2013)。胰島素耐受主要發(fā)生在肝臟、骨骼肌和脂肪細胞 3 個部位。在肝臟的脂肪酸或者葡萄糖使脂肪酸的代謝脫離線粒體的氧化途徑，轉(zhuǎn)而進行酯化途大量的脂質(zhì)，進而激活絲氨酸激酶，磷酸化胰島素受體，使胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分最后肝臟產(chǎn)生胰島素耐受。而在骨骼肌細胞中，過量的脂肪酸造成脂肪酸的非，未完全氧化的脂質(zhì)積累在線粒體內(nèi)，產(chǎn)生大量的自由基，進而引發(fā)肌細胞的，激活絲氨酸激酶阻礙胰島素信號的傳導(dǎo)而引起骨骼肌的胰島素耐受 (Jensen )。2 型糖尿病另外一個病理特征是 β 細胞的損傷，過多的營養(yǎng)攝入需要胰島合胰島素，大量的胰島素合成增加了 β 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負擔(dān)，引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激使

受到胰腺或者胰島供體不足以及長期使用免疫抑制劑的限制 (Shapiro et al. 2016)。來，細胞療法成為治療糖尿病的一種新方法，通過促進 β 細胞的再生而獲得功能成β 細胞已經(jīng)成為國內(nèi)外的研究熱點。1.2.2 獲得功能 β 胞的方法1.2.2.1 誘導(dǎo)干細胞分化成 β 樣細胞由于干細胞具有自我更新和多向分化的潛能，誘導(dǎo)胚胎干細胞（ESCs）或者成細胞分化、獲得功能成熟的 β 細胞成為體外獲得大量 β 細胞的方法，打破了 β 細胞供體不足對糖尿病臨床治療的限制。我們知道，胰腺是由內(nèi)胚層發(fā)育而來的，在胚育過程中，ESCs 在 TGF-β、activin、Wnt 和(PI(3)K)-AKT 等信號通路的作用下，定化成內(nèi)胚層 (D'Amour et al. 2005; D'Amour et al. 2006; Kubo et al. 2004; Mclean e2007; Stainier 2002)。隨后在維甲酸、BMP（骨形態(tài)發(fā)生蛋白）以及 Hedgehog 的作用發(fā)育成 PDX1+胰腺祖細胞 (Diiorio et al. 2002; Roy et al. 2001; Stafford and Prince 2Tiso et al. 2002)。隨后 FGF10 激活 Notch 信號通路調(diào)控胰腺祖細胞向胰腺導(dǎo)管細胞分泌細胞和外分泌細胞發(fā)育 (Bhushan et al. 2001; Hart et al. 2003)。

圖 1-3 促進 β 細胞增殖的細胞因子(Tarasov and Rorsma 1-3 β-Cell Proliferation Is Stimulated by Circulating Factors(T1 與 STAT3 信號通路1 概述1 是絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serpins）超家族的一員。上，Serpins 是由單體蛋白組成的超家族，大小范分支，每個分支包含 3-77個成員 (Silverman et al., 2一員，被稱為單核-嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑，抑制多種蛋白酶的活性，如嗜中性彈性蛋白酶，a et al. 2002; Cooley et al. 2001)。1 的研究進展1 通過抑制蛋白酶的活性來調(diào)控炎癥反應(yīng) (Silverm SerpinB1 與免疫性疾病、癌癥以及糖尿病發(fā)生的

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 楚元奎;曹暉;王峗;張翊華;竇忠英;;胎豬胰腺干細胞體外誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細胞及其移植治療裸鼠糖尿病的研究[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2011年01期

2 蔣澤生;高毅;慕寧;;共培養(yǎng)誘導(dǎo)人骨髓多能成體祖細胞分化為肝細胞樣細胞[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2007年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 楚元奎;胎豬胰島間充質(zhì)干細胞分離鑒定及向胰島素分泌細胞分化的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

本文編號：2822036