【摘要】：研究背景和目的:糖尿病神經(jīng)病理痛(diabetic neuropathic pain,DNP)是糖尿病的常見并發(fā)癥之一,伴有自發(fā)性疼痛、知覺過敏和植物神經(jīng)功能障礙,通常表現(xiàn)為肢體遠(yuǎn)端特別是下肢皮膚燒灼樣疼痛,嚴(yán)重的還可導(dǎo)致焦慮或抑郁樣行為。糖尿病有時會引起抑郁癥等大腦認(rèn)知功能障礙,另一方面抑郁(depression,DP)也是導(dǎo)致糖尿病神經(jīng)病理痛發(fā)展的一個危險因素。當(dāng)DNP和DP共同發(fā)病時,會對患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生極大的影響。P2X_7受體是ATP門控離子通道家族中的一員,研究表明其可能參與了痛覺信息的調(diào)制和傳導(dǎo)以及抑郁癥的發(fā)病。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中可促進(jìn)神經(jīng)元的生長、分化并維持神經(jīng)元的存活,在海馬、基底核及前腦活躍表達(dá),并已證實與抑郁密切相關(guān)。二氫楊梅素(Dihydromyricetin,DHM)可降低糖尿病大鼠血糖血脂,減弱神經(jīng)損害作用。本課題通過建立糖尿病神經(jīng)病理性疼痛合并抑郁癥模型,研究二氫楊梅素對糖尿病神經(jīng)病理痛合并抑郁癥大鼠海馬P2X_7受體和BDNF的影響及其機(jī)制,為臨床治療糖尿病神經(jīng)病理痛合并抑郁癥提供新的實驗依據(jù)。方法:將實驗大鼠隨機(jī)分為:正常對照組(Control組)、正常+二氫楊梅素組(Control+DHM組)、模型+生理鹽水組(DNP+DP組)、模型+二氫楊梅素組(DNP+DP+DHM組)、模型+P2X_7拮抗劑A438079(DNP+DP+A438079)組。建立糖尿病神經(jīng)病理痛合并抑郁癥模型,通過足底機(jī)械痛閾值(MWT)、熱痛敏閾值(TWL)、糖水偏好實驗(SPT)、強(qiáng)迫游泳不動時間(IMFST)、曠場實驗(OFT)觀察大鼠行為變化。通過QPCR和蛋白印跡來檢測各組大鼠海馬中P2X_7、BDNF、TrkB的表達(dá)。采用免疫組化方法觀察海馬中P2X_7和BDNF的表達(dá),并通過免疫熒光雙標(biāo)的方法來檢測海馬中嘌呤受體P2X_7與GFAP(膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物)共表達(dá)的情況。采用ELISA檢測各組大鼠血清炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的變化情況。采用蛋白印跡實驗檢測大鼠海馬中ERK1/2及其磷酸化程度的變化。結(jié)果:1、造模成功后,模型組大鼠的MWT、TWL、SPT和OFT值與Control組相比顯著性降低,IMFST顯著升高(p0.01),給予二氫楊梅素和拮抗劑處理后,DNP+DP+DHM組和DNP+DP+A438079的MWT、TWL、SPT和OFT值較DNP+DP組明顯升高,IMFST顯著降低(p0.01),而Control組與Control+DHM組相比其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。2、QPCR結(jié)果表明,DNP+DP組海馬P2X_7受體表達(dá)較Control組明顯升高(p0.01),BDNF、TrkB的表達(dá)明顯下降(p0.05);二氫楊梅素和拮抗劑處理后,DNP+DP+DHM組和DNP+DP+A438079組海馬P2X_7受體較DNP+DP組明顯降低(p0.01),BDNF、TrkB的表達(dá)明顯升高(P0.05);而Control組與Control+DHM組相比其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。3、蛋白印跡結(jié)果表明,各組總TrkB表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),與Control組比較,DNP+DP組中P2X_7的表達(dá)水平顯著升高(P0.01),BDNF蛋白和p-TrkB蛋白的表達(dá)明顯下降(P0.05);DNP+DP+DHM組和DNP+DP+A438079組海馬P2X_7的表達(dá)較DNP+DP組明顯降低(p0.05),BDNF蛋白和p-TrkB蛋白的表達(dá)明顯升高(P0.05);而Control組與Control+DHM組相比其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。4、免疫組化結(jié)果顯示,DNP+DP組海馬P2X_7受體的表達(dá)較Control組明顯升高(p0.01),DNP+DP+DHM組和DNP+DP+A438079組較DNP+DP組明顯降低(p0.01);DNP+DP組海馬BDNF的表達(dá)較Control組明顯下降(p0.05),DNP+DP+DHM組和DNP+DP+A438079組較DNP+DP組明顯升高(p0.05);而Control組與Control+DHM組相比其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。5、免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果表明,DNP+DP組大鼠海馬膠質(zhì)細(xì)胞P2X_7受體和GFAP的共表達(dá)增高,二氫楊梅素和A438079能對此起到抑制作用。6、ELISA檢測結(jié)果表明,DNP+DP組血清TNF-α和IL-1β水平較Control組明顯升高(p0.01),DNP+DP+DHM組和DNP+DP+A438079組較DNP+DP組明顯下降(p0.01),而Control組與Control+DHM組相比其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。7、采用蛋白印跡方法測量海馬中ERK1/2磷酸化程度,結(jié)果表明:各實驗組中ERK1/2對β-actin的積分光密度比值無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),與Control組比較,DNP+DP組中p-ERK1/2對ERK1/2的積分光密度比值顯著升高,ERK1/2磷酸化程度明顯增強(qiáng)(P0.01);DNP+DP+DHM組和DNP+DP+A438079組ERK1/2磷酸化水平較DNP+DP組明顯降低(P0.01)。結(jié)論:二氫楊梅素可以抑制糖尿病神經(jīng)病理痛合并抑郁癥大鼠的疼痛和抑郁樣行為,與P2X_7拮抗劑A438079的效果相一致,其機(jī)制可能與降低海馬的P2X_7表達(dá),促進(jìn)海馬BDNF的表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致TNF-α和IL-1β的水平下降以及海馬ERK1/2磷酸化水平下降有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2
【圖文】：

2.2.1 動物模型和分組雄性 SD 大鼠，體重 180-220 g，由南昌大學(xué)動物科學(xué)研究中心提供，合格證號：SYXK(贛)2015-0003。高糖高脂喂養(yǎng) 4 周后，空腹 12 小時以上（禁食不禁水），腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）（30mg/kg），測其隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L 視為 2 型糖尿病大鼠模型建立成功，連續(xù)測 3 周行為學(xué)，篩選出有疼痛并發(fā)癥的大鼠，與此同時給予慢性不可預(yù)知性應(yīng)激刺激（4℃冰水游泳 5min，45℃熱水游泳 5min，夾尾 1min，傾籠 12h，晝夜顛倒 24h，禁食禁飲 24h）3 周，每周測糖水偏好試驗（SPT），強(qiáng)迫游泳試驗不動時間（IMFST）和曠場實驗（OFT）篩選出有糖尿病病理痛和抑郁癥共病的大鼠。將實驗大鼠隨機(jī)分為：正常對照組(Control 組)、正常+二氫楊梅素組（Control+ DHM 組）、模型 + 生理鹽水組 (DNP+DP 組 ) 、模型 + 二氫楊梅素組(DNP+DP+DHM 組)、模型+P2X7拮抗劑 A438079（DNP+DP+A438079）組。建模成功后予 DNP+DP+DHM 組腹腔注射二氫楊梅素 30mg/kg，每 24h 一次，連續(xù) 14 天；DNP+DP+A438079 組腹腔注射 A438079 拮抗劑 80umol/kg，每 48h 一次，連續(xù) 14 天。

第 3 章實驗結(jié)果第 3 章 實驗結(jié)果機(jī)械痛敏閾值和熱縮足反射潛伏期測定結(jié)果雄性成年的 SD 大鼠進(jìn)行糖尿病合并抑郁癥模型的制備，STZ知性應(yīng)激刺激 3 周后 DNP 合并 DP 建模成功，模型組較 Con和熱縮足反射潛伏期顯著下降（p<0.01），模型大鼠隨機(jī)分成+DP+DHM 組、DNP+DP+A438079 組，從第 4 周開始打藥+DHM 組和 DNP+DP+A438079 組機(jī)械痛敏閾值和熱縮足反射 DNP+DP 組相比有顯著性差異(p<0.01)，而 Control 組與 Con統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）（Fig 2）。

第 3 章實驗結(jié)果3.2 大鼠糖水偏嗜度、強(qiáng)迫游泳不動時間和曠場實驗測量結(jié)果STZ 注射加慢性不可預(yù)知性應(yīng)激刺激 3 周后 DNP 合并 DP 建模成功，慢性不可預(yù)知性應(yīng)激刺激 3 周后 DNP+DP 組、DNP+DP+DHM 組、DNP+DP+A438079組較 Control 組糖水偏嗜度和曠場運(yùn)動總距離顯著下降（p<0.01），強(qiáng)迫游泳不動時間顯著升高（p<0.01），從第 4 周開始打藥，第 5 周 DNP+DP+DHM 組和DNP+DP+A438079 組糖水偏嗜度和曠場運(yùn)動總距離明顯增加，強(qiáng)迫游泳不動時間明顯下降，與 DNP+DP 組相比有顯著性差異(p<0.01)，而 Control 組與Control+DHM 組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）（Fig3）。

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