【摘要】：研究背景和目的:糖尿病神經病理痛(diabetic neuropathic pain,DNP)是糖尿病的常見并發(fā)癥之一,伴有自發(fā)性疼痛、知覺過敏和植物神經功能障礙,通常表現為肢體遠端特別是下肢皮膚燒灼樣疼痛,嚴重的還可導致焦慮或抑郁樣行為。糖尿病有時會引起抑郁癥等大腦認知功能障礙,另一方面抑郁(depression,DP)也是導致糖尿病神經病理痛發(fā)展的一個危險因素。當DNP和DP共同發(fā)病時,會對患者的生活質量產生極大的影響。P2X_7受體是ATP門控離子通道家族中的一員,研究表明其可能參與了痛覺信息的調制和傳導以及抑郁癥的發(fā)病。腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在神經系統發(fā)育中可促進神經元的生長、分化并維持神經元的存活,在海馬、基底核及前腦活躍表達,并已證實與抑郁密切相關。二氫楊梅素(Dihydromyricetin,DHM)可降低糖尿病大鼠血糖血脂,減弱神經損害作用。本課題通過建立糖尿病神經病理性疼痛合并抑郁癥模型,研究二氫楊梅素對糖尿病神經病理痛合并抑郁癥大鼠海馬P2X_7受體和BDNF的影響及其機制,為臨床治療糖尿病神經病理痛合并抑郁癥提供新的實驗依據。方法:將實驗大鼠隨機分為:正常對照組(Control組)、正常+二氫楊梅素組(Control+DHM組)、模型+生理鹽水組(DNP+DP組)、模型+二氫楊梅素組(DNP+DP+DHM組)、模型+P2X_7拮抗劑A438079(DNP+DP+A438079)組。建立糖尿病神經病理痛合并抑郁癥模型,通過足底機械痛閾值(MWT)、熱痛敏閾值(TWL)、糖水偏好實驗(SPT)、強迫游泳不動時間(IMFST)、曠場實驗(OFT)觀察大鼠行為變化。通過QPCR和蛋白印跡來檢測各組大鼠海馬中P2X_7、BDNF、TrkB的表達。采用免疫組化方法觀察海馬中P2X_7和BDNF的表達,并通過免疫熒光雙標的方法來檢測海馬中嘌呤受體P2X_7與GFAP(膠質細胞標記物)共表達的情況。采用ELISA檢測各組大鼠血清炎性細胞因子TNF-α和IL-1β的變化情況。采用蛋白印跡實驗檢測大鼠海馬中ERK1/2及其磷酸化程度的變化。結果:1、造模成功后,模型組大鼠的MWT、TWL、SPT和OFT值與Control組相比顯著性降低,IMFST顯著升高(p0.01),給予二氫楊梅素和拮抗劑處理后,DNP+DP+DHM組和DNP+DP+A438079的MWT、TWL、SPT和OFT值較DNP+DP組明顯升高,IMFST顯著降低(p0.01),而Control組與Control+DHM組相比其差異無統計學意義(p0.05)。2、QPCR結果表明,DNP+DP組海馬P2X_7受體表達較Control組明顯升高(p0.01),BDNF、TrkB的表達明顯下降(p0.05);二氫楊梅素和拮抗劑處理后,DNP+DP+DHM組和DNP+DP+A438079組海馬P2X_7受體較DNP+DP組明顯降低(p0.01),BDNF、TrkB的表達明顯升高(P0.05);而Control組與Control+DHM組相比其差異無統計學意義(p0.05)。3、蛋白印跡結果表明,各組總TrkB表達無統計學意義(p0.05),與Control組比較,DNP+DP組中P2X_7的表達水平顯著升高(P0.01),BDNF蛋白和p-TrkB蛋白的表達明顯下降(P0.05);DNP+DP+DHM組和DNP+DP+A438079組海馬P2X_7的表達較DNP+DP組明顯降低(p0.05),BDNF蛋白和p-TrkB蛋白的表達明顯升高(P0.05);而Control組與Control+DHM組相比其差異無統計學意義(p0.05)。4、免疫組化結果顯示,DNP+DP組海馬P2X_7受體的表達較Control組明顯升高(p0.01),DNP+DP+DHM組和DNP+DP+A438079組較DNP+DP組明顯降低(p0.01);DNP+DP組海馬BDNF的表達較Control組明顯下降(p0.05),DNP+DP+DHM組和DNP+DP+A438079組較DNP+DP組明顯升高(p0.05);而Control組與Control+DHM組相比其差異無統計學意義(p0.05)。5、免疫熒光雙標結果表明,DNP+DP組大鼠海馬膠質細胞P2X_7受體和GFAP的共表達增高,二氫楊梅素和A438079能對此起到抑制作用。6、ELISA檢測結果表明,DNP+DP組血清TNF-α和IL-1β水平較Control組明顯升高(p0.01),DNP+DP+DHM組和DNP+DP+A438079組較DNP+DP組明顯下降(p0.01),而Control組與Control+DHM組相比其差異無統計學意義(p0.05)。7、采用蛋白印跡方法測量海馬中ERK1/2磷酸化程度,結果表明:各實驗組中ERK1/2對β-actin的積分光密度比值無統計學意義(p0.05),與Control組比較,DNP+DP組中p-ERK1/2對ERK1/2的積分光密度比值顯著升高,ERK1/2磷酸化程度明顯增強(P0.01);DNP+DP+DHM組和DNP+DP+A438079組ERK1/2磷酸化水平較DNP+DP組明顯降低(P0.01)。結論:二氫楊梅素可以抑制糖尿病神經病理痛合并抑郁癥大鼠的疼痛和抑郁樣行為,與P2X_7拮抗劑A438079的效果相一致,其機制可能與降低海馬的P2X_7表達,促進海馬BDNF的表達上調,導致TNF-α和IL-1β的水平下降以及海馬ERK1/2磷酸化水平下降有關。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2
【圖文】：

2.2.1 動物模型和分組雄性 SD 大鼠，體重 180-220 g，由南昌大學動物科學研究中心提供，合格證號：SYXK(贛)2015-0003。高糖高脂喂養(yǎng) 4 周后，空腹 12 小時以上（禁食不禁水），腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）（30mg/kg），測其隨機血糖≥16.7mmol/L 視為 2 型糖尿病大鼠模型建立成功，連續(xù)測 3 周行為學，篩選出有疼痛并發(fā)癥的大鼠，與此同時給予慢性不可預知性應激刺激（4℃冰水游泳 5min，45℃熱水游泳 5min，夾尾 1min，傾籠 12h，晝夜顛倒 24h，禁食禁飲 24h）3 周，每周測糖水偏好試驗（SPT），強迫游泳試驗不動時間（IMFST）和曠場實驗（OFT）篩選出有糖尿病病理痛和抑郁癥共病的大鼠。將實驗大鼠隨機分為：正常對照組(Control 組)、正常+二氫楊梅素組（Control+ DHM 組）、模型 + 生理鹽水組 (DNP+DP 組 ) 、模型 + 二氫楊梅素組(DNP+DP+DHM 組)、模型+P2X7拮抗劑 A438079（DNP+DP+A438079）組。建模成功后予 DNP+DP+DHM 組腹腔注射二氫楊梅素 30mg/kg，每 24h 一次，連續(xù) 14 天；DNP+DP+A438079 組腹腔注射 A438079 拮抗劑 80umol/kg，每 48h 一次，連續(xù) 14 天。

第 3 章實驗結果第 3 章 實驗結果機械痛敏閾值和熱縮足反射潛伏期測定結果雄性成年的 SD 大鼠進行糖尿病合并抑郁癥模型的制備，STZ知性應激刺激 3 周后 DNP 合并 DP 建模成功，模型組較 Con和熱縮足反射潛伏期顯著下降（p<0.01），模型大鼠隨機分成+DP+DHM 組、DNP+DP+A438079 組，從第 4 周開始打藥+DHM 組和 DNP+DP+A438079 組機械痛敏閾值和熱縮足反射 DNP+DP 組相比有顯著性差異(p<0.01)，而 Control 組與 Con統計學意義（p>0.05）（Fig 2）。

第 3 章實驗結果3.2 大鼠糖水偏嗜度、強迫游泳不動時間和曠場實驗測量結果STZ 注射加慢性不可預知性應激刺激 3 周后 DNP 合并 DP 建模成功，慢性不可預知性應激刺激 3 周后 DNP+DP 組、DNP+DP+DHM 組、DNP+DP+A438079組較 Control 組糖水偏嗜度和曠場運動總距離顯著下降（p<0.01），強迫游泳不動時間顯著升高（p<0.01），從第 4 周開始打藥，第 5 周 DNP+DP+DHM 組和DNP+DP+A438079 組糖水偏嗜度和曠場運動總距離明顯增加，強迫游泳不動時間明顯下降，與 DNP+DP 組相比有顯著性差異(p<0.01)，而 Control 組與Control+DHM 組相比無統計學意義（p>0.05）（Fig3）。

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