【摘要】：目的:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種多系統(tǒng)累及的慢性自身免疫性疾病。SLE發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是自身反應(yīng)性B細(xì)胞激活,生成大量針對(duì)細(xì)胞核、細(xì)胞漿以及其他細(xì)胞成分的自身免疫性抗體。無(wú)能B細(xì)胞是存于外周循環(huán)系統(tǒng)中通過(guò)克隆無(wú)能機(jī)制達(dá)到免疫耐受狀態(tài)的具有自身反應(yīng)性的一群B淋巴細(xì)胞,具有發(fā)展成為致病性自身反應(yīng)性B細(xì)胞的潛能。以CD19+CD27-Ig D+Ig M-/low為表面標(biāo)記的BND細(xì)胞是目前公認(rèn)的無(wú)能B細(xì)胞標(biāo)記。文獻(xiàn)報(bào)道,BND細(xì)胞免疫耐受狀態(tài)的紊亂與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病等自身免疫性疾病的發(fā)病相關(guān)。但是,有關(guān)SLE患者的BND細(xì)胞研究較少。本研究對(duì)SLE患者BND細(xì)胞免疫耐受狀態(tài)進(jìn)行了檢測(cè),并對(duì)其免疫耐受狀態(tài)紊亂的機(jī)制進(jìn)行了探索。方法:1.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SLE患者和健康對(duì)照外周血BND細(xì)胞比例,并將患者BND細(xì)胞比例與臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析;2.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SLE患者外周血BND細(xì)胞表面CD分子、BCR刺激后鈣離子內(nèi)流水平、BCR刺激后胞內(nèi)酪氨酸磷酸化升高程度,用以評(píng)估SLE患者外周血BND細(xì)胞免疫耐受狀態(tài);3.流式分選SLE患者和健康對(duì)照的BND細(xì)胞以及CD19+CD27-Ig D+Ig M+B細(xì)胞,并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以了解BND細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征;4.通過(guò)SLE患者和HC血漿交叉培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、血漿細(xì)胞因子差異檢測(cè)、以及Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子體外刺激實(shí)驗(yàn)明確對(duì)BND細(xì)胞起調(diào)控作用的細(xì)胞因子;5.通過(guò)分析SLE患者血漿IL-4表達(dá)水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性、全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)明確IL-4是否與SLE發(fā)病相關(guān);6.建立無(wú)能B細(xì)胞體外模型以便進(jìn)行功能研究;7.利用無(wú)能B細(xì)胞體外模型,探索IL-4對(duì)無(wú)能B細(xì)胞的調(diào)控作用;8.使用免疫共聚焦顯微鏡、間接標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)、熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)探索IL-4對(duì)無(wú)能B細(xì)胞免疫耐受調(diào)節(jié)的機(jī)制。結(jié)果:1.與健康對(duì)照相比,SLE患者外周血BND細(xì)胞比例降低,且SLE患者外周血BND細(xì)胞比例與疾病活動(dòng)度負(fù)相關(guān),糖皮質(zhì)激素治療能夠上調(diào)患者BND細(xì)胞比例;2.SLE患者外周血BND細(xì)胞表面CD80、CD86、CD95和CD71與健康對(duì)照無(wú)明顯差異;BCR刺激后,SLE患者BND細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流水平和酪氨酸磷酸化升高程度均比健康對(duì)照升高,表明其BCR信號(hào)通路的應(yīng)答能力增強(qiáng),提示SLE患者BND細(xì)胞免疫耐受狀態(tài)紊亂,處于相對(duì)活化狀態(tài);3.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析提示,SLE患者的BND細(xì)胞在細(xì)胞活化、增殖、分化相關(guān)基因的表達(dá)與健康對(duì)照存在差異;功能以及通路分析提示SLE患者的BND細(xì)胞在活化、免疫調(diào)控、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等方面與健康對(duì)照存在差異;4.SLE患者血漿高表達(dá)IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ,且只有IL-4能在體外培養(yǎng)時(shí)降低外周血BND細(xì)胞比例;5.SLE患者血漿IL-4表達(dá)水平與SLEDAI評(píng)分正相關(guān),與補(bǔ)體C3、C4負(fù)相關(guān);GWAS分析提示IL-4與SLE疾病相關(guān);6.抗CD79b單克隆抗體可以在體外誘導(dǎo)na?ve B細(xì)胞成為無(wú)能B細(xì)胞;7.IL-4可以上調(diào)無(wú)能B細(xì)胞表面Ig M從而逆轉(zhuǎn)無(wú)能B細(xì)胞免疫耐受狀態(tài);8.IL-4通過(guò)促進(jìn)內(nèi)化的Ig M再循環(huán)到細(xì)胞表面以及促進(jìn)Ig M的新合成而上調(diào)細(xì)胞表面Ig M,且這種作用是通過(guò)p-STAT6介導(dǎo)的。結(jié)論:我們的研究明確了SLE患者外周血BND細(xì)胞比例降低,且BND細(xì)胞比例與SLE疾病活動(dòng)度相關(guān),是潛在的疾病活動(dòng)度評(píng)價(jià)指標(biāo)。SLE患者BND細(xì)胞的BCR信號(hào)通路的應(yīng)答能力高于健康對(duì)照,表明SLE的BND細(xì)胞的免疫耐受狀態(tài)紊亂,處于相對(duì)活化狀態(tài)。我們首次對(duì)健康人以及SLE患者的BND細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,探索了無(wú)能相關(guān)的基因及通路,為深入探索無(wú)能B細(xì)胞免疫耐受機(jī)制打下了基礎(chǔ)。此外,我們發(fā)現(xiàn)SLE患者血漿中高表達(dá)的IL-4可以通過(guò)上調(diào)BND細(xì)胞表面Ig M的表達(dá),實(shí)現(xiàn)對(duì)BND細(xì)胞免疫耐受狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)。而且IL-4是通過(guò)增加p-STAT6的表達(dá)而促進(jìn)內(nèi)化的Ig M再循環(huán)到細(xì)胞表面以及促進(jìn)Ig M的新合成來(lái)逆轉(zhuǎn)無(wú)能B細(xì)胞免疫耐受狀態(tài)。我們的研究為SLE的治療尋找了新的治療策略,即可以通過(guò)誘導(dǎo)外周B細(xì)胞無(wú)能或者靶向阻斷IL-4信號(hào)通路來(lái)治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R593.241
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、SLE外周血 BND細(xì)胞比例與疾病活動(dòng)度相關(guān)性分析（一）SLE 患者外周血 BND細(xì)胞比例低于 HC為比較 SLE 患者與健康對(duì)照外周血 BND細(xì)胞比例是否存在差異，我們將兩組的外周血用密度梯度離心法分離后，按照 Duty等人[13]使用的流式設(shè)門方法，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血 BND細(xì)胞占 B 細(xì)胞的百分比，進(jìn)而比較 SLE 患者與健康對(duì)照之間的差異。流式設(shè)門方法見圖 1，首先用 CD19 圈出 B細(xì)胞；然后用 CD27和 IgD將 B細(xì)胞劃分為 CD19+CD27-IgD+幼稚 B 細(xì)胞（na ve B cells）、CD19+CD27+記憶 B細(xì)胞（memory B cells）、CD19+CD27-IgD-雙陰性 B細(xì)胞（DN B cells）；na ve B細(xì)胞根據(jù)表面 IgM 表達(dá)劃分為 BND細(xì)胞（CD19+CD27-IgD+IgMlo/-）和 CNB 細(xì)胞（CD19+CD27-IgD+IgM+）。

HC SLE p-valueNo. of subjects 46 40 -Sex (male:female) 5:41 4:36 >0.9999Age (years) 37.5 (24, 45.25) 35.3 (24, 43.75) 0.5589BNDcells/na ve B cells (%) 3.17 (1.69,4.66 ) 0.85 (0.16, 2.35) <0.0001BNDcells/B cells (%) 1.65 (1.00, 2.56) (0.33, 0.1, 3.17) <0.0001Na ve B cells/B cells (%) 58.6 (44.48, 67.55) 49.6 (29.75, 76.3) 0.304Memory B cells/B cells (%) 27.46 (19.63, 40.9) 32.69 (13.2, 45.6) 0.687DN B cells/B cells (%) 12.05 (9.03, 17.15) 12.9 (5.93, 19.55) 0.916B cells/Lymphocytes (%) 2.31 (1.85, 4.83) 2.72 (1.58, 5.88) 0.947BNDcells：無(wú)能 B 細(xì)胞；DN B cells：雙陰性 B 細(xì)胞。計(jì)量資料采用 Mann-WhitneyU test 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；計(jì)數(shù)資料采用 Fisher’s exact test 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，p<0.05 認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

無(wú)能 B細(xì)胞免疫耐受狀態(tài)紊亂參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機(jī)制的研究（二）SLE 患者外周血 na ve B 細(xì)胞表面 IgM 表達(dá)水平高于 HC因?yàn)榧?xì)胞表面 IgM 的低表達(dá)是無(wú)能 B細(xì)胞的特征，所以 SLE患者中 BND細(xì)胞比例的降低與 na ve B細(xì)胞表面 IgM 表達(dá)升高應(yīng)該保持一致。于是，我們比較了 HC 和SLE 患者 na ve B 細(xì)胞表面 IgM 的平均熒光強(qiáng)度（MFI）。結(jié)果顯示：SLE 患者na ve B 細(xì)胞表面 IgM 的表達(dá)水平高于 HC 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 3B，p<0.0001）；作為對(duì)比，SLE 患者 na ve B 細(xì)胞表面 IgD 的表達(dá)水平與 HC 組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 3A）。

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本文編號(hào)：2787772