【摘要】：類風濕類節(jié)炎(RA)是一種慢性、系統(tǒng)性自身免疫病,成纖維樣滑膜細胞(FLS)類腫瘤樣增生是RA的特征性病理表現(xiàn),樹突狀細胞(DCs)作為功能強大的抗原提呈細胞,在炎癥免疫反應中起重要作用。DCs上有前列腺素受體(EP)四種亞型的表達,但RA DCs上EP不同亞型的表達情況及其對DC功能的調(diào)控尚不清楚；前列腺素E2 (PGE2)是引起FLS異常增殖的重要分子之一,PGE2通過G蛋白偶聯(lián)的EP信號通路調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平是滑膜細胞異常增殖的重要機制,G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRKs)是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)的負性調(diào)節(jié)劑,可特異性地活化GPCRs,使其磷酸化,從而介導受體脫敏,但FLS對EP信號尤其是對EP4信號的的調(diào)節(jié)未見報道。課題組將白芍總苷(TGP)的活性單體芍藥苷(Pae)進行酯化修飾,得到的新型活性單體-苯磺酰芍藥苷(芍藥苷-6-氧-苯磺酸酯,代號CP-25)具有一定的抗炎作用。然而CP-25對免疫性關節(jié)炎是否具有治療作用,其作用機制如何,還不清楚。本課題在以往研究工作基礎上,建立大鼠佐劑性關節(jié)炎(AA)模型,以DCs和FLS為研究細胞,運用流式細胞術、QRT-PCR、免疫印跡、免疫共沉淀、激光共聚焦、小干擾RNA等技術,觀察PGE2對DCs和FLS功能的影響及CP-25的作用,為揭示PGE2及其信號轉導參與RA異常炎癥免疫反應的病理機制及CP-25的作用靶點提供實驗依據(jù)。目的：觀察PGE2及其信號對大鼠DCs和FLS功能的影響及CP-25對大鼠AA的治療作用及機制,為揭示PGE2及其信號轉導參與RA異常炎癥免疫反應的病理機制以及CP-25的作用靶點提供實驗依據(jù)。方法：采用完全弗氏佐劑制備大鼠AA模型,取大鼠骨髓源細胞,經(jīng)rIL-4、rGM-CSF刺激誘導生成骨髓源DCs; QRT-PCR法檢測EP mRNA各亞型的表達。流式細胞術檢測DCs抗原攝取功能和表型CD80, CD86, CD40和MHCⅡ的表達及FLS表面EP4和GRK2的表達；DCs與T細胞的混合淋巴細胞反應(MLR)和FLS的增殖采用CCK-8法檢測；ELISA法檢測PGE2, IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-23和cAMP的水平；CP-25灌胃給藥,進行多發(fā)性關節(jié)炎指數(shù)評分；HE染色觀察關節(jié)病理；激光共聚焦顯微觀察法檢測EP4和GRK2在FLS上的分布；免疫共沉淀法檢測FLS上EP4和GRK2的相互作用；siRNA瞬時沉默F(xiàn)LS中GRK2基因表達；Western blot法檢測EP4和GRK2在FLS胞膜表達。結果：1.PGE2信號對AA大鼠DCs功能的影響大鼠骨髓源DCs表達EP的四種亞型,與正常大鼠相比較,AA模型大鼠骨髓源DCs上EP4 mRNA表達明顯上調(diào)。在AA大鼠病程研究中發(fā)現(xiàn),骨髓源DCs分泌的PGE2, TNF-α, IL-23等炎癥介質(zhì)和細胞因子在AA大鼠繼發(fā)性炎癥高峰期和緩解期均較致炎前顯著升高；外周血CD103+細胞中DC共刺激分子CD40和CD86在d7就較致炎前升高,CD80和MHCⅡ在繼發(fā)性炎癥初始階段(d17)開始增加,而在BMDCs中,MHCⅡ、 CD86和CD40均在原發(fā)性炎癥階段(d7)就開始升高,隨著炎癥的加重,這些DCs表型表達均顯著升高。提示,在AA炎性進程中,PGE2、 EP及DC表型出現(xiàn)異常變化。體外進一步模擬AA炎性環(huán)境,在TNF-α刺激下,觀察PGE2對DCs功能的影響,結果發(fā)現(xiàn)PGE2刺激組DCs的抗原攝取能力明顯降低,PGE2可濃度依賴性的增加DCs的IL-23分泌,同時,顯著增加DCs的IL-12分泌,增加DCs對T細胞的刺激能力。EP4激動劑CAY10598可模擬PGE2對DCs的效應,增強DCs對T淋巴細胞的刺激能力,上調(diào)DCs表面CD80的表達,而EP2激動劑Butaprost和CAY10598可促進DCs的IL-23分泌,上調(diào)MHCⅡ和CD86的表達,但EP1和EP3激動劑Sulprostone對這些功能沒有影響。cAMP類似物dbcAMP增加DCs的IL-23、L-12產(chǎn)生和MHCⅡ及共刺激分子(CD80, CD86)的表達,說明PGE2/EP4-cAMP信號介導的DCs功能異常參與了AA炎癥反應。研究還發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑上調(diào)了PGE2誘導DCs的IL-23和IL-12產(chǎn)生,但抑制了DCs表面MHCⅡ及共刺激分子(CD80, CD86)的表達,PI3K參與PGE2調(diào)控DCs功能的機制有待進一步研究。2.PGE2信號對AA大鼠FLS功能的影響TNF-α在AA大鼠早期炎癥反應即開始升高,在炎癥高峰期(d23)和炎癥緩解期(d30), PGE2和TNF-α均較致炎前高。PGE2可濃度依賴性的刺激FLS增殖,10μM時刺激作用最強。Western blot和流式檢測均提示AA大鼠FLS胞膜蛋白EP4顯著降低；GRK2在胞膜中表達顯著升高。那么GRK2的高表達是否與胞膜EP4降低有關呢?我們用PGE2刺激AA大鼠FLS,結果發(fā)現(xiàn)GRK2在PGE2刺激10 min就開始升高,隨著刺激時間的延長,GRK2表達呈上升趨勢。而EP4在PGE2刺激20 min開始表達升高,2 h左右達高峰,12 h時表達較未刺激時降低。為進一步分析FLS胞膜EP4減少的原因,先用PGE2 (10μM)預刺激30 min,可升高FLS細胞膜上EP4表達,然后在PGE2基礎上再用EP4激動劑刺激FLS,結果發(fā)現(xiàn)EP4激動劑可逐漸降低胞膜EP4表達,刺激30min時低于基礎水平,而胞膜GRK2表達逐漸升高。與對照組相比較,TNF-α組在同等條件下EP4表達降低更明顯,GRK2表達卻逐漸升高。其下游信號分子cAMP經(jīng)PGE2預刺激可明顯增加,但隨著EP4激動劑刺激時間的延長,cAMP水平逐漸降低,30 min時低于未刺激組,1h時cAMP濃度降低有統(tǒng)計學差異。TNF-α組在同等條件下,cAMP 水平降低更明顯,提示在TNF-α炎性細胞因子作用下,EP4激動劑可進一步促進EP4的脫敏,從而導致下游信號cAMP水平的降低。激光共聚焦顯微鏡觀察FLS,發(fā)現(xiàn)EP4和GRK2主要分布在胞漿和胞膜,經(jīng)共定位顯示Overlap Coeffcient為0.6595,提示EP4和GRK2存在一定的相互作用；免疫共沉淀法進一步顯示,在正常情況下,GRK2-EP4有比較弱的作用,EP4激動劑刺激1h顯著增加GRK2的表達,提示GRK2-EP4的相互作用增強。為進一步探討GRK2在EP4異常脫敏中的作用及PGE2對FLS功能的影響,用siRNA沉默GR.K2基因表達后,發(fā)現(xiàn)可取消PGE2引起的FLS異常增殖,EP4在激動劑刺激下逐漸向細胞膜聚集,隨著刺激時間的延長EP4胞膜表達逐漸升高。經(jīng)PGE2預刺激的FLS再用EP4激動劑刺激30 min和24 h的胞內(nèi)產(chǎn)生cAMP水平與未刺激的GR.K2基因沉默F(xiàn)LS相比無顯著性差異。這些結果表明GRK2在調(diào)節(jié)滑膜細胞異常增殖中發(fā)揮了重要的作用,其可能通過促進EP4脫敏,導致下游信號分子cAMP水平降低從而引起FLS的異常增殖。3.CP-25對大鼠AA的治療作用及部分機制CP-25可明顯降低AA大鼠的多發(fā)性關節(jié)炎指數(shù)評分,可不同程度的改善關節(jié)病理變化,主要表現(xiàn)為炎性細胞浸潤減少,滑膜細胞增生減輕,炎性滲出和血管翳形成減少,滑膜組織破壞軟骨、骨罕見。表明CP-25對大鼠AA具有治療作用。CP-25可不同程度降低PGE2和TNF-α水平,降低AA大鼠FLS的異常增殖反應。CP-25可顯著下調(diào)DCs表面MHCⅡ, CD40和CD80的表達,但對CD86的表達無明顯影響。CP-25體外給藥可提高DCs的吞噬能力,下調(diào)CD80, CD86和MHCⅡ的表達,抑制對T細胞的增殖作用,不同程度的抑制IL-23分泌。CP-25體外給藥可不同程度抑制FLS的增殖,且呈明顯的濃度效應關系。CP-25可顯著升高胞膜EP4的表達,同時不同程度抑制胞膜GRK2表達。進一步在體外把DCs和FLS按一定比例進行接觸式混合培養(yǎng),以部分模擬體內(nèi)的環(huán)境,結果發(fā)現(xiàn),PGE2處理的DCs可顯著促進FLS的增殖,增加FLS分泌IL-1β, CP-25體外給藥可不同程度抑制FLS的增殖及細胞因子的分泌。此外,把PGE2處理的FLS與DCs按1比10比例進行混合培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)PGE2處理的FLS,可顯著促進DCs分泌TNF-α,而CP-25處理的FLS可抑制DCs分泌TNF-α,體外實驗進一步證實了CP-25可以改善FLS和DCs的功能,提示CP-25可能通過調(diào)節(jié)AA大鼠異常的免疫功能和抑制FLS的異常增殖而發(fā)揮治療作用。結論：1.PGE2及其EP4-cAMP信號亢進導致AA大鼠DCs功能異�；罨�,并與病程相關；2.AA大鼠PGE2異常升高,導致EP4膜表達下降(過度脫敏),與FLS異常增殖以及與FLS和DCs的相互活化有關；3.AA大鼠FLS的GRK2異常升高,并EP4共表達,可能是導致EP4脫敏的主要原因；4.CP-25對大鼠AA的治療作用與其改善DCs功能、抑制FLS異常增殖和分泌炎癥因子有關,該作用可能是通過降低FLS GRK2膜表達和上調(diào)EP4膜表達,抑制EP4的過度脫敏實現(xiàn)的。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R593.22

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