【摘要】：骨質(zhì)疏松癥是一種常見的全身代謝性骨病,主要特征為骨密度降低,骨量低下,骨微結(jié)構(gòu)損壞,可以導致骨脆性增加以及骨折風險的顯著提升。隨著我國人口老齡化問題的日益嚴重,骨質(zhì)疏松給社會造成的經(jīng)濟負擔問題逐漸凸顯。然而,目前的骨質(zhì)疏松藥物存在昂貴、療效較差或是副作用比較大等各種問題。脈沖電磁場(PEMF)及機械振動被認為是兩種非侵入式的價格低廉且安全有效的骨質(zhì)疏松的物理治療方法已經(jīng)在臨床上得到認證,然而其具體的作用機制及最優(yōu)參數(shù)選擇仍然不明確。本研究通過對骨骼內(nèi)的兩種關鍵細胞—骨細胞及破骨細胞施加不同參數(shù)的兩種物理因子,檢測觀察其行為及功能的變化,探究其中的調(diào)控機制。本研究的研究結(jié)果提示:(1)PEMF對骨細胞及破骨細胞的調(diào)控具有強度依賴性,5 G為PEMF作用于兩種細胞以達到抑制破骨細胞骨吸收的最優(yōu)參數(shù);(2)機械振動對骨骼細胞的調(diào)控具有頻率依賴性,70 Hz為作用于RAW264.7細胞抑制破骨細胞活性及骨吸收功能的最優(yōu)參數(shù),而50 Hz是機械振動作用于骨細胞然后抑制RAW264.7細胞生成的破骨細胞活性及骨吸收功能的最優(yōu)參數(shù);(3)骨細胞樣MLO-Y4細胞可以通過分泌細胞因子RANKL及OPG對RAW264.7細胞向破骨細胞分化的過程進行調(diào)控,不同參數(shù)的兩種物理因子可以對RANKL及OPG的分泌產(chǎn)生影響從而調(diào)控分化過程。(4)骨細胞樣MLO-Y4細胞通過初級纖毛感應及介導外界PEMF刺激。第一部分:不同強度脈沖電磁場對破骨細胞的形成、凋亡及骨吸收能力的影響背景:PEMF在體內(nèi)實驗中可以增加骨量,骨質(zhì)疏松動物的骨形成速率明顯提高,同時在體外實驗中也增強了成骨細胞活性和成骨細胞礦化能力。已經(jīng)有文獻報道了PEMF刺激具有促進成骨細胞生成能力,但是目前對于PEMF作用于破骨細胞時對破骨細胞活性和功能的調(diào)節(jié)作用及相關機制仍然缺乏足夠的理解。方法:使用不同強度(0,5,10,20及30 G)的15 Hz的PEMF刺激RANKL誘導的RAW264.7細胞,通過鬼筆環(huán)肽染色檢測形成的破骨細胞F-actin細胞骨架結(jié)構(gòu)變化,通過TRAP染色觀察生成的破骨細胞數(shù)目,通過SEM檢測破骨細胞骨吸收能力,通過Annexin v-FITC/PI染色檢測細胞凋亡,通過qRT-PCR對骨吸收及凋亡相關基因進行檢測。結(jié)果:5 G時大部分形成的破骨細胞具有不成熟的破骨細胞F-actin細胞骨架結(jié)構(gòu),破骨細胞數(shù)目較少,骨吸收能力較差,而且細胞凋亡被抑制。隨著強度的升高,細胞逐漸顯示出成熟破骨細胞細胞骨架結(jié)構(gòu),破骨細胞數(shù)目增多,且凋亡的破骨細胞數(shù)目增加。此外,RANK,NFATc1,TRAP,CTSK,BAX和BAX/BCL-2的基因表達在5 G組顯著降低,在30 G組明顯增加。結(jié)論:PEMF可以直接作用于破骨細胞前體細胞,對破骨細胞的形成、凋亡及骨吸收能力的有調(diào)控作用,且具有強度依賴性,其中5 G可作為PEMF抗骨吸收功能的最優(yōu)參數(shù),主要通過抑制破骨細胞的形成和成熟而使骨吸收能力顯著降低。第二部分:脈沖電磁場對骨細胞的影響及對破骨細胞活性的抑制依賴于初級纖毛背景:初級纖毛廣泛存在于各種細胞表面,能感知細胞外機械和化學信號變化并協(xié)助其轉(zhuǎn)導至細胞內(nèi)部,從而引起細胞應答。本實驗研究骨細胞對不同強度電磁場的響應,然后通過沉默MLO-Y4骨細胞構(gòu)建初級纖毛必須的Polaris基因檢測細胞響應是否依然存在,由此可以探索初級纖毛是否是骨細胞感應脈沖電磁場并做出反應的器官。方法:使用不同強度(0,5,30 G)的PEMF作用于MLO-Y4細胞,系統(tǒng)檢測其對骨細胞增殖、凋亡、F-actin及相關基因表達水平的影響。使用不同組的骨細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細胞,觀察其向破骨細胞分化的影響。通過CCK-8檢測骨細胞增殖,通過Annexin v-FITC/PI及流式細胞儀檢測骨細胞凋亡,通過鬼筆環(huán)肽染色檢測細胞骨架結(jié)構(gòu)變化,通過si RNA轉(zhuǎn)染干擾骨細胞初級纖毛形成,通過TRAP染色觀察破骨細胞數(shù)目,通過SEM及甲苯胺藍染色檢測破骨細胞骨吸收能力,通過ELISA檢測分泌性RANKL及OPG的變化,通過qRT-PCR對RANKL/OPG通路及凋亡相關基因進行檢測。結(jié)果:骨細胞凋亡和肌動蛋白細胞骨架結(jié)構(gòu)受到PEMF刺激的強度依賴性調(diào)節(jié)。由PEMF刺激的骨細胞條件培養(yǎng)基誘導的破骨細胞的形成和骨吸收能力在受到5 G的PEMF刺激時被抑制。在受到PEMF刺激后,RANKL,BCL-2的表達水平及RANKL/OPG的比率均降低。當對骨細胞的初級纖毛進行干擾后,5 G的PEMF刺激后的MLO-Y4條件培養(yǎng)基對破骨細胞活性及骨吸收能力的抑制作用被減弱。結(jié)論:骨細胞可以感應PEMF刺激,并且細胞對PEMF的響應具有強度依賴性。5 G為PEMF刺激作用于骨細胞抑制骨吸收作用的最優(yōu)參數(shù)。骨細胞的初級纖毛對其感受及介導PEMF刺激起著重要作用。第三部分:不同頻率的振動應力對RAW264.7細胞的破骨細胞形成及骨吸收能力的影響背景:機械振動的抗骨丟失已經(jīng)形成共識,但是其具體機制仍不清楚。而且,成骨效應是否只是就成骨細胞效應的結(jié)果,還是對體內(nèi)的破骨細胞也有作用?因此,研究不同頻率的振動對骨細胞活性、破骨細胞分化、骨吸收能力的影響能更好的闡述防治骨質(zhì)疏松的機制。方法:本實驗使用不同頻率的機械振動(Control,30 Hz,50 Hz,70 Hz)直接作用于破骨細胞前體RAW264.7細胞,觀察振動對破骨細胞分化、成熟、骨吸收功能的影響。通過鬼筆環(huán)肽染色檢測細胞骨架結(jié)構(gòu)變化,通過TRAP染色觀察破骨細胞數(shù)目,通過甲苯胺藍染色檢測破骨細胞骨吸收能力,通過qRT-PCR對骨吸收能力及凋亡的相關基因進行檢測。結(jié)果:受到不同頻率機械振動刺激后,RAW264.7細胞生成的破骨細胞數(shù)目均減少,骨吸收能力減弱,F-actin細胞骨架結(jié)構(gòu)改變,且50 Hz及70 Hz的細胞骨架結(jié)構(gòu)變形較嚴重。不同頻率下,MMP-9、TRAP、CTSK的表達均被抑制。受到30 Hz機械振動刺激后,BAX/BCL-2比值明顯升高。結(jié)論:機械振動可以直接作用于RANKL誘導下的RAW264.7細胞,明顯地抑制破骨細胞前體細胞向破骨細胞分化及其骨吸收功能,抑制作用的程度與頻率的大小相關。隨著頻率的升高,機械振動對生成的破骨細胞數(shù)目及其骨吸收能力的抑制作用越明顯。機械振動對于骨質(zhì)疏松的治療作用機制并不僅體現(xiàn)于對成骨細胞的調(diào)控,也與其對破骨細胞的調(diào)控緊密相關。第四部分:不同頻率機械振動對骨細胞的影響及其對破骨細胞分化及骨吸收能力的調(diào)控背景:本實驗旨在研究機械振動在骨骼中發(fā)揮抗吸收作用以此達到治療骨質(zhì)疏松作用的細胞機制及分子機制。方法:檢測使用不同頻率(0,30 Hz,50 Hz及70 Hz)的機械振動作用于MLO-Y4細胞后,檢測細胞凋亡、F-actin細胞骨架結(jié)構(gòu)及相關基因表達水平的變化;然后使用骨細胞的條件培養(yǎng)基對RAW264.7細胞進行培養(yǎng),檢測其向破骨細胞分化的能力的變化。通過Annexin v-FITC/PI及流式細胞儀檢測細胞凋亡,通過鬼筆環(huán)肽染色檢測F-actin細胞骨架結(jié)構(gòu)變化,通過TRAP染色觀察破骨細胞數(shù)目,通過甲苯胺藍染色檢測破骨細胞骨吸收能力,通過ELISA檢測分泌性RANKL及OPG的變化,通過qRT-PCR對RANKL/OPG通路及凋亡相關基因進行檢測。結(jié)果:MLO-Y4細胞受到不同頻率的機械振動刺激后,細胞凋亡、RANKL/OPG比值、誘導形成的破骨細胞數(shù)目及骨吸收能力均減少,其中50 Hz時抑制作用最強。F-actin細胞骨架結(jié)構(gòu)改變,其中70 Hz時變形嚴重,細胞核形變、細胞皺縮且細胞間突觸連接網(wǎng)絡被破壞。結(jié)論:機械振動可以抑制骨細胞的凋亡及RANKL/OPG比率,骨細胞通過分泌可溶性因子RANKL及OPG可以對RAW264.7細胞的破骨細胞分化及骨吸收作用進行調(diào)節(jié),抑制破骨細胞活性。而50 Hz是作用于骨細胞后抑制破骨細胞活性最明顯的頻率參數(shù)。
【學位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R580
【圖文】：

長的細胞突的樹突狀細胞[8]。如圖 1 所示，根據(jù)形態(tài)學觀察及分子特征，成骨細胞向骨細胞的過渡階段可以被分為幾個不同的時期：1=前成骨細胞；2=成骨細胞；3=嵌入成骨細胞；4=骨樣骨細胞；5=礦化骨細胞；6 和 7=成熟骨細胞。如圖 1B 所示為成年小鼠脛骨的四鉻染色切片圖，具體地展現(xiàn)了在圖 1A 示意圖中出現(xiàn)的一些成骨細胞向骨細胞過渡階段（bar=25 μm）。在轉(zhuǎn)換過程中，骨細胞與其成骨細胞前提細胞具有許多相同的標記物，然而骨細胞還會表達一些特異的在改變其功能和形態(tài)方面起關鍵性作用的標記基因。圖 1C中的表格說明了在從成骨細胞向骨細胞的轉(zhuǎn)變過程中（如圖 1A 和 B 所示）各種成骨標志物的相對時間表達。RUNX2 指導早期成骨細胞分化，并在成骨細胞和前成骨細胞中表達。骨鈣素（OCN）由成熟的成骨細胞和早期的骨細胞表達。E11 是在分化過程中表達最早的骨細胞標志物，但在體內(nèi)成熟的骨細胞中沒有發(fā)現(xiàn)[9]。在礦化和成熟的骨細胞中觀察到 DMP1，CapG 和 MEPE 表達[10,11]，而 Sclerostin 的表達僅限于成熟的骨細胞[12]，ORP150 也僅在礦化骨基質(zhì)缺氧環(huán)境中的成熟骨細胞中發(fā)現(xiàn)。

圖 2 骨細胞的分子標記特征[1]（隨著成骨細胞嵌入骨基質(zhì)并分化成骨細胞，基因表達模式發(fā)生變化�！硎驹摶蛟谶@些細胞中比在成骨細胞細胞系的其他細胞中更高的表達）1.1.4 骨細胞細胞骨架細胞中存在的許多感覺微結(jié)構(gòu)，使它能夠感知檢測到機械刺激，細胞的機械感應通過力誘導的構(gòu)象變化實現(xiàn)，如拉伸活化的離子通道，整合素復合物和細胞間的粘附。構(gòu)象變化引起離子的流入和流出或是信號級聯(lián)的激活，導致細胞性狀的改變和蛋白質(zhì)的活性及產(chǎn)生的改變。細胞骨架是一種復合凝膠樣材料，包括肌動蛋白，微管，中間絲和它們的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，可以決定細胞形狀和硬度，是細胞的機械結(jié)構(gòu)[27]。分子如整聯(lián)蛋白，錨定到細胞外基質(zhì)并將細胞外部機械連接到細胞骨架，形成跨膜復合物結(jié)構(gòu)。這些復合物通常聚集在粘著斑中，被認為與機械轉(zhuǎn)導高度相關[28,29]。因為細胞骨架的存在，細胞能夠耐受一定程度的剪切力與壓縮力，使得細胞遷移、細胞內(nèi)分子傳輸變?yōu)榭赡�，它也決定了細胞的機械學特點，使其具備機械傳感

空軍軍醫(yī)大學博士學位論文分化的多核破骨細胞粘附在礦化的骨基質(zhì)上，就可以開始吸收骨化，如圖 3 所示，其膜被重組為四個獨特的漿膜區(qū)域：密封區(qū)（sea貼附在基體上；富含膜的褶皺緣膜（ruffled border，RB）相對于外側(cè)區(qū)域（basolateral domain，BD）；和遠離基質(zhì)的細胞基極的nctional secretory domain，F(xiàn)SD）。

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6 暨南大學醫(yī)藥生物技術研究開發(fā)中心 姚成燦;TGF-β：重塑傲骨舍我其誰[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

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10 記者 王小龍;科學家發(fā)現(xiàn)破骨細胞抑制劑[N];科技日報;2009年

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