【摘要】：類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)致殘性病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊�。與其他類(lèi)型關(guān)節(jié)炎的區(qū)別在于,RA受累關(guān)節(jié)的主要病理表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、持續(xù)性滑膜炎、血管翳形成、滑膜組織異常增生以及軟骨和骨的進(jìn)行性破壞等。RA發(fā)病早期T細(xì)胞依賴(lài)性自身免疫導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔內(nèi)發(fā)生炎性滲出,進(jìn)入慢性期后非T細(xì)胞依賴(lài)性滑膜過(guò)度增生、侵襲破壞關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨是RA晚期關(guān)節(jié)軟骨破壞的重要原因。因此,深入研究RA關(guān)節(jié)軟骨破壞相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程,探尋其中的重要環(huán)節(jié)和關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,對(duì)于更好地防治RA有著極其重要的意義。我們前期的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在RA滑膜成纖維樣細(xì)胞中存在一種特殊的、具有受體酪氨酸蛋白激酶活性的盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體DDR2且呈高表達(dá)狀態(tài);它以膠原為配體,通過(guò)同源二聚化使其胞內(nèi)區(qū)第471位酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾,處于持續(xù)活化狀態(tài),促進(jìn)MMP1和MMP13的大量分泌,參與RA關(guān)節(jié)軟骨破壞;體外表達(dá)純化的DDR2受體胞外區(qū)蛋白可與DDR2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合II型膠原,抑制RA FLS分泌MMP1,在CIA大鼠模型中觀(guān)察到可溶性的DDR2可改善關(guān)節(jié)軟骨的破壞。因此,我們提出在RA滑膜組織增生侵襲破壞軟骨的進(jìn)程中可能存在這樣一個(gè)惡性循環(huán):在異常的自身免疫狀態(tài)下,軟骨脫落的II型膠原激活滑膜成纖維樣細(xì)胞中的DDR2受體,從而誘導(dǎo)滑膜成纖維樣細(xì)胞過(guò)表達(dá)MMPs;DDR2受體在膠原強(qiáng)大而持續(xù)的作用下持續(xù)活化,使得滑膜成纖維樣細(xì)胞不斷地分泌MMPs,這些持續(xù)分泌的MMPs對(duì)骨和軟骨產(chǎn)生嚴(yán)重的破壞;然而,被破壞的軟骨又可進(jìn)一步釋放大量的膠原物質(zhì),隨即成為MMPs的誘導(dǎo)因素,如此反復(fù),周而復(fù)始。然而從膜受體DDR2活化到胞內(nèi)效應(yīng)分子MMPs的過(guò)度分泌,其中詳細(xì)的作用機(jī)制及關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子尚不清楚。CYR61是我們利用Agilent Human 1A基因表達(dá)譜芯片對(duì)II型膠原刺激前后RA滑膜成纖維樣細(xì)胞進(jìn)行差異分析獲得的基因,為了深入探討CYR61在DDR2-MMPs通路中扮演的角色及其對(duì)RA關(guān)節(jié)軟骨破壞的作用,我們進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)研究:首先,我們利用Real-time PCR、Western-blot以及免疫組化等實(shí)驗(yàn)技術(shù)系統(tǒng)分析DDR2、CYR61以及MMPs在RA滑膜組織中的表達(dá)水平和表達(dá)分布,評(píng)價(jià)CYR61在RA發(fā)生、發(fā)展的臨床意義;其次,應(yīng)用Real-time PCR和蛋白免疫印跡觀(guān)察上調(diào)或者下調(diào)DDR2的活化水平對(duì)CYR61表達(dá)水平的影響并通過(guò)EMSA、雙熒光素酶報(bào)告基因、Real-time PCR和蛋白免疫印跡等方法闡明DDR2調(diào)控CYR61表達(dá)的分子機(jī)制,從而揭示II型膠原-DDR2-CYR61通路的存在;接著,以過(guò)表達(dá)腺病毒Ad-CYR61和CYR61 si RNA為研究工具,采用Real-time PCR和蛋白免疫印跡方法驗(yàn)證CYR61對(duì)下游效應(yīng)分子MMPs的影響,同時(shí),綜合運(yùn)用生物信息學(xué)、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、染色質(zhì)免疫共沉淀以及凝膠遷移實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)方法,深入探討CYR61調(diào)控MMPs表達(dá)的具體分子機(jī)制;然后,使用Transwell和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)關(guān)鍵分子CYR61對(duì)RA滑膜成纖維樣細(xì)胞侵襲遷移功能的影響;最后,通過(guò)構(gòu)建Wistar大鼠CIA模型,給予干涉腺病毒sh CYR61局部治療,阻斷動(dòng)物關(guān)節(jié)局部CYR61的表達(dá),來(lái)評(píng)估腺病毒sh CYR61對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療效果。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)研究我們獲得了下列結(jié)果:①Real-time PCR結(jié)果顯示,RA患者滑膜組織中DDR2、CYR61以及MMP1、MMP9、MMP13的m RNA表達(dá)水平均高于OA患者滑膜組織,DDR2與CYR61 m RNA的表達(dá)水平呈正相關(guān),CYR61與MMP1m RNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)。②蛋白免疫印跡結(jié)果同樣顯示,RA患者滑膜組織中DDR2、CYR61及MMP1的蛋白表達(dá)水平均顯著高于OA患者滑膜組織。免疫組化結(jié)果顯示,DDR2、MMP1均表達(dá)于滑膜襯里層,DDR2與MMP1在RA滑膜組織中的表達(dá)水平高于OA;CYR61則泛表達(dá)于多種組織中,RA滑膜及滑膜下結(jié)締組織中CYR61的表達(dá)水平高于OA。③利用Real-time PCR和蛋白免疫印跡觀(guān)察上調(diào)或者下調(diào)DDR2的活化水平對(duì)CYR61表達(dá)水平的影響,結(jié)果顯示II型膠原刺激DDR2活化能夠促進(jìn)CYR61的表達(dá),干涉DDR2抑制CYR61的m RNA和蛋白表達(dá)水平。④EMSA和雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示II型膠原誘導(dǎo)DDR2活化可增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子AP-1在CYR61啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合活性,從而誘導(dǎo)CYR61轉(zhuǎn)錄活性升高,促進(jìn)CYR61的表達(dá)。⑤CYR61能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子ETS1轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)。⑥雙熒光素酶報(bào)告基因、Ch IP和EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)錄因子ETS1通過(guò)與MMP1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-122~-102 bp啟動(dòng)子序列直接結(jié)合,增強(qiáng)MMP1的轉(zhuǎn)錄活性,促進(jìn)MMP1的表達(dá)。⑦Transwell和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CYR61能夠促進(jìn)FLS細(xì)胞侵襲遷移功能。⑧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干涉CYR61的表達(dá)能夠明顯降低關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率和關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分,顯著改善關(guān)節(jié)軟組織腫脹程度;⑨X射線(xiàn)和Micro-CT檢查結(jié)果提示,干涉腺病毒sh CYR61對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)軟骨破壞具有良好的治療效果;⑩組織病理學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻斷CYR61的表達(dá)能夠減少炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。本研究中我們首次證實(shí)了CYR61作為DDR2-MMPs通路中的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在介導(dǎo)DDR2過(guò)分泌MMPs及促進(jìn)RA FLS細(xì)胞侵襲遷移和關(guān)節(jié)軟骨損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用。該研究結(jié)果完善和補(bǔ)充了DDR2-MMPs通路中關(guān)鍵環(huán)節(jié)和關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,為進(jìn)一步闡明RA中晚期病變的發(fā)病機(jī)制及新的藥物靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)提供了新思路。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R593.22
【圖文】：

圖 0-1 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血管翳中的免疫及病理機(jī)制示意圖引自：AbelesAM. Bull NYU Hosp Jt Dis. 2006; 64: 20-24.

圖 0-2 DDRs 結(jié)構(gòu)示意圖引自：Brigit. Int Rev Cell Mol Biol. 2014; 310: 39-87.特點(diǎn)泛表達(dá)于胚胎發(fā)育階段和成人個(gè)體的不同組織，如骨骼、統(tǒng)和免疫系統(tǒng)。目前，尚沒(méi)有文獻(xiàn)系統(tǒng)的分析不同組織中 不同類(lèi)型細(xì)胞中，DDR2 的表達(dá)受不同轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，下，大鼠心臟平滑肌細(xì)胞中 DDR2 啟動(dòng)子區(qū) Myc-Max DNR2 表達(dá)水平升高[18]；在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子 ACAAT 增強(qiáng)子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn) DDR2 轉(zhuǎn)錄；肝損傷可mRNA 表達(dá)水平上調(diào)[19]。Sekiya 等[20]發(fā)現(xiàn) microRNA-29 b 達(dá)，由于 microRNA-29 b 下游靶基因是 I 型膠原，故 I 型

本文編號(hào)：2740916