【摘要】：目的:1.純合型家族性高膽固醇血癥(Homozygous Familial Hypercholesterolemia,HoFH)是一種嚴(yán)重的由基因突變導(dǎo)致的脂蛋白代謝障礙類疾病,可導(dǎo)致兒童或青年期早發(fā)冠心病并危及生命。就目前對雜合高膽固醇血癥(Familial Hypercholesterolemia,FH)的研究看來,中國FH患者的遺傳背景與其它國家及種族人群差異明顯,但目前尚未有大樣本的針對中國HoFH患者的系統(tǒng)研究。本研究旨在針對中國唯一的大樣本HoFH隊列進行臨床特征及遺傳背景等信息的研究,探索我國HoFH常見致病突變的種類、頻率、地域分布規(guī)律,為建立我國的FH基因篩查方法提供實驗室基礎(chǔ)。2.目前針對FH的基因檢測多用于疑似FH患者的確診,很少用于輔助臨床鑒別診斷特殊病例或探索基因型與臨床表型之間的關(guān)聯(lián)。本研究第二部分通過2例臨床診斷為FoFH基因型檢測為FeFH的特殊病例,探索基因檢測用于輔助鑒別診斷特殊病例,并探索通過基因突變解讀臨床表型的應(yīng)用。3.FH患者的早期診斷對于該人群生存期的延長以及生存質(zhì)量的提高等方面都至關(guān)重要,而我國實際得到早期診斷并得到適當(dāng)治療的人數(shù)極少,除了部分致病突變尚不明確外,另一重要原因就是現(xiàn)有檢測方法費用昂貴。目前廣泛采用的FH篩查策略中,通過膽固醇水平來檢測初步篩選可疑的FH患者,再通過目標(biāo)區(qū)域捕獲富集或擴增子進行下一代的方法性價比較高,但作為FH這種發(fā)病率較低的疾病的篩查手段來說,成本仍然過高,難以大范圍開展。本研究在此次情況下,建立和優(yōu)化了基于下一代測序的二階段式多基因區(qū)FH突變基因檢測方法,探索適合我國國情的FH基因篩查方法,以促進提高FH的診斷率。本研究對于有效篩查和早期診斷FH,解決我國FH基因篩查的瓶頸問題具有重要意義。研究方法:1.本研究從全國招募來自45個HoFH家系和7個HeFH家系的48例HoFH患者、14例HeFH患者和1例健康的HoFH親屬。所有登記的個人都被要求提供完整的病歷,包括以前在其他醫(yī)院就診的病歷。常規(guī)采集患者外周血分離血清標(biāo)本,使用日立7600-020自動分析儀(日本日立)按照醫(yī)院檢驗科日常檢測流程對其血脂水平進行檢測。全血標(biāo)本提取基因組DNA后使用SureSelectXT Custom 0.5-2.9Mb Kit建庫試劑盒創(chuàng)建文庫,并使用Hiseq 4000測序儀(illumina,美國)根據(jù)雙端150bp測序的官方標(biāo)準(zhǔn)操作流程進行測序。使用ANNOVAR進行注釋,通過DbSNP、1000Genome、ExAC、CADD和HGMD等多種數(shù)據(jù)庫獲得變異位置、變異類型、保守性預(yù)測等信息。再通過基因轉(zhuǎn)錄注釋數(shù)據(jù)庫(如Concesus CDS、RefSeq、Ensembl和UCSC)來獲得氨基酸的改變信息。所有變異位點都使用SIFT、Polyphen2_HDIV、Polyphen2_HVAR、MutationTaster、FATHMM、CADD、LRT以及gerp++gt2等生信預(yù)測算法進行功能及致病性預(yù)測。所有可疑致病位點根據(jù)AMCG指南(2015)標(biāo)準(zhǔn)進行致病性分級。2.針對臨床診斷為HoFH基因型診斷為HeFH的兩名患者,收集并分析家族史,個人疾病史和生活習(xí)慣等信息,結(jié)合實驗室自主設(shè)計的FH基因篩查方法對患者及其親屬的DNA樣本下一代測序篩查和Sanger測序驗證結(jié)果進行FH基因診斷。使用生信算法對檢測到的可疑致病變異進行注釋和功能預(yù)測,并使用SWISS-MODEL對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行建模,預(yù)測檢測到的突變對相關(guān)蛋白的功能影響,揭示上述基因型為FeFH的患者臨床表型的可能原因。3.根據(jù)遺傳性脂代謝疾病的相關(guān)基因信息選取目的基因24個。利用DesignStudio對這24個基因的外顯子及UTR區(qū)域進行設(shè)計和優(yōu)化,最終形成個性化定制的FH基因篩查Panel。選取安貞醫(yī)院貞心團隊招募入組且應(yīng)用NGS測序法發(fā)現(xiàn)并經(jīng)Sanger測序驗證的攜帶已知突變位點的FH患者全血凍存樣本10例。抽提全血基因組DNA后按照1,2,4,6,8,10例等濃度混樣,并使用自主設(shè)計的Panel構(gòu)建文庫,應(yīng)用Miseq測序平臺測序,使用Basespace自帶程序?qū)Ξa(chǎn)出數(shù)據(jù)進行注釋和分析,分析后得出的結(jié)果再次以Sanger測序法驗證,最后與NGS+Sanger測序得出的結(jié)果進行比對。結(jié)果:1.我國HoFH常見致病突變的分布規(guī)律本研究來自16個省的63個個體中,HoFH組中包括21名男性和27名女性,基線LDL-C水平為14.11+/-3.39 mmol/L;HeFH組中包括7名男性和7名女性,基線LDL-C水平為6.56+/-1.85 mmol/L。48例臨床HoFH基因檢測發(fā)現(xiàn),有7例患者基因是純合突變,占14.58%;其他41例均為復(fù)合雜合突變。55個變異位點被確認(rèn)為class 3或class 4或class5的致病變異。其中,18個變異位點為新發(fā)現(xiàn)的變異位點:APOB基因第26號外顯子上的c.T10927C(p.S3643P);LDLR基因第3號外顯子上的c.T310G(p.C104G)和c.G292A(p.G98S),第4號外顯子上的c.338_342del(p.E113fs)和c.649_660del(p.217_220del),第5號外顯子上的c.G764T(p.C255F)、c.T727A(p.C243S)和c.720_721del(p.E240fs),第7號外顯子上的c.T973C(p.C325R),第8號外顯子上的c.T1129G(p.C377G)和c.A1178C(p.K393T),第10號外顯子上的c.C1427T(p.P476L)和c.T1532G(p.L511X),第11號外顯子上的c.1693_1696del(p.G565fs),第13號外顯子上的:c.G1980C(p.Q660H)和c.1899delC(p.R633fs),第17號外顯子上的c.G2487C(p.Q829H);PCSK9基因第9號外顯子上的c.C1426T(p.R476C),本研究首次報道。檢出上述新突變提示我國目前尚有眾多潛在HeFH患者未被發(fā)現(xiàn),在HoFH中檢測到的突變?yōu)楦Ｒ姷耐蛔冾愋?可以據(jù)此進行FH常見突變篩查。我國FH患者的LDLR致病突變集中于exon4,exon9,exon10區(qū)域,突變位點的分布有地域差異,東北地區(qū)尤為明顯。發(fā)現(xiàn)3個高頻突變位點:W483X(11.7%)、p.H583Y(7.45%)和p.A627T(5.32%),高頻位點主要集中于我國中部及東部地區(qū),如安徽、河南與湖北。入組的63個個體來自16個省份,其中,有7個LDLR基因上的位點在多個省份出現(xiàn),包括p.W483X在5個省份有發(fā)現(xiàn);p.H583Y和p.A627T在4個省份有發(fā)現(xiàn);c.C1216A和c.1187-10GA在3個省份有發(fā)現(xiàn);p.P685L和p.C243S在2個省份有發(fā)現(xiàn)。并且發(fā)現(xiàn)相同變異位點的省份地理位置分布也相對臨近。2.基因檢測輔助鑒別診斷HoFH在常規(guī)劑量的依折麥布和他汀類藥物治療下,患者的膽固醇水平有效降低至原始水平的33.8%和17.2%。確定了低密度脂蛋白受體(LDLR)中的兩個致病突變W483X和新報道突變W483G。兩個患者都是各自突變的雜合子。在高膽固醇/碳水化合物飲食影響下,這些突變可能引發(fā)嚴(yán)重的FH臨床表型,但兩位患者對常規(guī)醫(yī)學(xué)治療方案和飲食控制的反應(yīng)良好。W483X突變導(dǎo)致終止碼插入并進一步導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不完整。盡管根據(jù)SWISSMODEL模擬的結(jié)構(gòu)來看,W483G突變不影響蛋白質(zhì)的完整翻譯也沒有明顯影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),但它仍然導(dǎo)致了類似W483X的嚴(yán)重FH表型(符合臨床HoFH確診標(biāo)準(zhǔn))。3.建立二階式FH突變基因檢測方法實驗室自主設(shè)計的Panel覆蓋目標(biāo)區(qū)域的98%,目標(biāo)全長共計123,509bp�；鞓訕颖旧蠙C后產(chǎn)出數(shù)據(jù)Q30堿基百分比為72.19-83.26,擴增子的平均覆蓋值為563.4-1668.6,檢出SNV數(shù)量為212-347個,檢出堿基插入數(shù)量為41-54個,缺失數(shù)量為79-114個。檢出的SNV和Indel可以覆蓋目標(biāo)區(qū)域,但有部分區(qū)域覆蓋不良。當(dāng)人均覆蓋深度超過200*時混樣檢測可以達到100%的已知突變檢出率,而低于100乘時結(jié)果則不甚可靠,檢出率僅達21.43%。介于100到200乘之間的樣本位點檢出率在70%-90%。與常規(guī)目標(biāo)區(qū)域NGS測序進行對比,結(jié)果顯示本研究采用的方法可以將檢測成本降低69.2%,并節(jié)約41.2%的檢測時間。結(jié)論:1.本研究首次獲得了來自16個省份的大樣本HoFH隊列的中國HoFH常見致病突變,并發(fā)現(xiàn)了常見致病突變的分布與地理位置相關(guān)。2.發(fā)現(xiàn)W483G新突變,擴展了東北地區(qū)FH的突變譜。揭示了兩種突變在某些條件下引起嚴(yán)重的FH表型,提示W(wǎng)483位點有可能對維持LDLR正常功能有重要意義,提供了遺傳篩查或藥物開發(fā)的潛在靶點。3.建立24個FH相關(guān)基因外顯子區(qū)域的靶向區(qū)域NGS測序方法,初步顯示可輔助FH基因診斷及鑒別診斷FH相關(guān)疾病,并輔助指導(dǎo)臨床治療方案的選擇,同時可以大幅降低檢測成本和時間。4.自建方法在應(yīng)用于臨床之前,實驗流程還有待改良和完善,同時還需要加大樣本量對該方法的技術(shù)參數(shù)進行進一步的研究和驗證。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R589.2
【圖文】：

3 個致病位點。另一方面，計算出有效數(shù)據(jù)和靶標(biāo)區(qū)域的平均覆蓋深度后當(dāng)人均覆蓋深度超過 200 乘時可以達到 100%的符合率，而低于 100 乘時結(jié)果常不可靠，符合率僅達 21.43%。介于 100 到 200 乘之間的樣本位點檢出符合70%-90%。3.4 實驗室自建方法的成本與檢測時間評估將應(yīng)用實驗室自主設(shè)計的二階段式檢測方法的檢測成本和檢測時間與常規(guī)區(qū)域 NGS 測序進行對比，結(jié)果顯示本研究采用的方法可以將檢測成本降低 6并節(jié)約 41.2%的檢測時間（見圖表 8）。

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本文編號：2740022