【摘要】：第一部分 人醛固酮瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的建立及細(xì)胞鑒定目的原發(fā)性醛固酮增多癥是最常見的繼發(fā)性高血壓的原因。其中醛固酮瘤為第二常見的原發(fā)性醛固酮增多癥亞型,早期手術(shù)治療效果好。目前已發(fā)現(xiàn)醛固酮瘤體系的致病基因主要是KCNJ5、CACNA1D、ATP2B3和ATP1A1。國際上通常利用突變基因轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系、H295R細(xì)胞系或HAC15細(xì)胞系的方法研究相應(yīng)的基因功能,缺乏利用原代培養(yǎng)技術(shù)研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展的研究。本研究擬建立醛固酮瘤的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法并進(jìn)行細(xì)胞鑒定,以進(jìn)一步探索腫瘤致病機(jī)制、功能及治療靶點(diǎn)等。方法1.取新鮮切除的人醛固酮瘤組織,用2%的I型膠原酶消化后種板。2.用倒置相差顯微鏡連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)。3.用放免法測(cè)定培養(yǎng)液中醛固酮濃度。4.用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)醛固酮合成酶表達(dá)。5.觀察醛固酮瘤細(xì)胞的分泌功能隨時(shí)間變化情況。結(jié)果1.原代培養(yǎng)的醛固酮瘤細(xì)胞貼壁生長,細(xì)胞呈圓形、三角形、多邊形。在體外環(huán)境中生長良好。2.原代培養(yǎng)第5天,培養(yǎng)液中醛固酮水平為1084.0 ±323.0 ng/dL,較腎上腺皮質(zhì)無功能瘤及皮質(zhì)醇瘤顯著升高。3.醛固酮瘤細(xì)胞中有醛固酮合成酶的免疫熒光表達(dá)。4.醛固酮瘤細(xì)胞培養(yǎng)第1天時(shí)分泌的醛固酮濃度最高,此后逐漸減弱,在第3天至第7天細(xì)胞分泌功能基本不變。結(jié)論本研究在國內(nèi)首次成功建立醛固酮瘤的原代培養(yǎng)方法并進(jìn)行了細(xì)胞鑒定,這有利于今后對(duì)醛固酮瘤的發(fā)病機(jī)制及功能的研究。第二部分鈣通道阻滯劑及主要調(diào)節(jié)醛固酮分泌的因素對(duì)醛固酮瘤細(xì)胞分泌功能的影響目的醛固酮瘤的致病基因主要包括KCNJ5、ATP2B3、ATP1A1和CACNA1D基因。KCNJ5基因突變最為常見,存在于35-70%的醛固酮瘤中。這些基因突變后均能使醛固酮瘤細(xì)胞上的電壓門控鈣通道開放,鈣內(nèi)流增加,鈣信號(hào)激活,從而促進(jìn)醛固酮合成增加。在轉(zhuǎn)染這些基因突變體的細(xì)胞中,已經(jīng)觀察到鈣通道阻滯劑(CCB)能減少醛固酮分泌,但在最符合人體病理生理狀態(tài)的人醛固酮瘤細(xì)胞中,CCB的作用如何卻不甚清楚,其他主要調(diào)節(jié)醛固酮分泌的因素對(duì)醛固酮瘤細(xì)胞的分泌功能影響也未闡明。本部分的研究目的即是探討CCB對(duì)醛固酮瘤細(xì)胞分泌醛固酮的影響,并比較不同類型CCB的作用的區(qū)別。同時(shí),觀察主要的醛固酮刺激因素,包括高鉀、血管緊張素II、促腎上腺皮質(zhì)激素和高鈉,對(duì)醛固酮瘤細(xì)胞分泌功能及細(xì)胞增殖的影響。方法1.采用第一部分研究建立的原代培養(yǎng)方法培養(yǎng)醛固酮瘤細(xì)胞,共成功培養(yǎng)23例醛固酮瘤的細(xì)胞用于下述實(shí)驗(yàn)。2.培養(yǎng)細(xì)胞分組:對(duì)照組、L/T雙通道CCB貝尼地平組(10μM)、L型CCB硝苯地平組(10μM)和T型CCB米貝地爾組(1OμM),處理細(xì)胞48h后收集培養(yǎng)液測(cè)醛固酮,收集細(xì)胞提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后行qPCR,檢測(cè)CYP11B2 mRNA的表達(dá)量。3.培養(yǎng)細(xì)胞分組:對(duì)照組、高鉀組(15mM)、血管緊張素II(100nM)和促腎上腺皮質(zhì)激素組(1OOnM),處理24h后,收集培養(yǎng)液檢測(cè)醛固酮水平,然后加入100μl培養(yǎng)基及10μlCCK-8,檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量。4.培養(yǎng)細(xì)胞分組:不同鈉濃度處理組(135、145、155、165、185mM),處理細(xì)胞24h后,收集培養(yǎng)液檢測(cè)醛固酮水平,然后加入100μl培養(yǎng)基及10μl CCK-8,檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量。5.Sanger測(cè)序法檢測(cè)這23個(gè)醛固酮瘤組織的體系突變。結(jié)果1.貝尼地平、米貝地爾和硝苯地平均能顯著抑制醛固酮瘤細(xì)胞的醛固酮分泌,三者的平均抑制率分別為25.5%、9.5%和17.8%。2.貝尼地平、米貝地爾和硝苯地平均能顯著抑制醛固酮瘤細(xì)胞的醛固酮合成酶CYP11B2mRNA表達(dá),其中貝尼地平的作用最強(qiáng)。3.促腎上腺皮質(zhì)激素能顯著刺激KCNJ5突變的細(xì)胞的醛固酮分泌(較對(duì)照組增加101.0±55.9%)以及細(xì)胞增殖。4.血管緊張素Ⅱ能顯著促進(jìn)KCNJ5突變的醛固酮瘤細(xì)胞分泌醛固酮(較對(duì)照組增加32.8±46.0%),但對(duì)細(xì)胞增殖無影響。5.促腎上腺皮質(zhì)激素組醛固酮水平及細(xì)胞增殖數(shù)較高鉀組及血管緊張素Ⅱ組顯著升高。6.高鉀對(duì)KCNJ5突變的醛固酮瘤細(xì)胞分泌醛固酮的功能及增殖均無影響。7.高鈉刺激KCNJ5突變的醛固酮瘤細(xì)胞分泌醛固酮,但不影響細(xì)胞增殖。8.用于CCB處理實(shí)驗(yàn)中的16例醛固酮瘤組織中有14例檢測(cè)出KCNJ5基因突變,在高鉀、血管緊張素Ⅱ、促腎上腺皮質(zhì)激素和高鈉處理實(shí)驗(yàn)中的7例醛固酮瘤組織中均檢測(cè)出KCNJ5基因突變。結(jié)論1.貝尼地平、米貝地爾、硝苯地平不僅能顯著抑制醛固酮瘤細(xì)胞的醛固酮水平,還能顯著抑制醛固酮瘤細(xì)胞CYP11B2mRNA的表達(dá)。2.ACTH是促進(jìn)KCNJ5突變的醛固酮瘤細(xì)胞增殖及分泌醛固酮的強(qiáng)有力的刺激。ATⅡ能刺激其分泌醛固酮,但作用較ACTH弱。3.首次發(fā)現(xiàn)高鈉能促進(jìn)KCNJ5突變的醛固酮瘤細(xì)胞分泌醛固酮,而高鉀不能刺激其分泌。4.此部分23例醛固酮瘤組織有21例均檢測(cè)到KCNJ5基因突變。在本研究的醛固酮瘤患者中(伴有高血壓及低鉀血癥),KCNJ5體系突變的檢出率高達(dá)91.3%。第三部分硝苯地平對(duì)人醛固酮瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響及qPCR驗(yàn)證目的鈣信號(hào)對(duì)正常情況下醛固酮合成的重要作用在多年前就已明確,但鈣離子下游的信號(hào)通路并不清楚。隨著醛固酮瘤的體系突變得到公認(rèn),KCNJ5、CACNA1D、ATP2B3和ATP1A1這四個(gè)突變基因激活的細(xì)胞內(nèi)的鈣信號(hào)也是其重要的致病機(jī)制,其鈣離子下游的信號(hào)通路也不清楚。轉(zhuǎn)錄組學(xué)能高通量的檢測(cè)某個(gè)時(shí)間的所有轉(zhuǎn)錄本,也可能發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄序列。本研究擬觀察硝苯地平處理對(duì)醛固酮瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組的影響。方法1.體外原代培養(yǎng)醛固酮瘤細(xì)胞。2.分成兩組:對(duì)照組和50μM硝苯地平處理組,處理48h。3.收集培養(yǎng)液測(cè)醛固酮水平,收集細(xì)胞RNA行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。4.選取對(duì)照組與硝苯地平處理組之間的差異基因,對(duì)部分有意義的基因行qPCR驗(yàn)證。結(jié)果1.共有2例患者完成了轉(zhuǎn)錄組學(xué)這部分實(shí)驗(yàn)。2例患者存在同樣的KCNJ5基因的氨基酸改變,即p.G151R。2.比較對(duì)照組與硝苯地平處理組的轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)40個(gè)表達(dá)量豐富且有顯著表達(dá)差異的基因。除了參與醛固酮合成的基因外,其他主要包括多個(gè)參與合成膽固醇及萜類化合物骨架的酶的基因,如HMGCR、HMGCS1、NSDHL、ACAT2、SDLE 等,log2FC 在-1.5 至-2.5 之間。Real-TimePCR 驗(yàn)證結(jié)果顯示,HMGCS1的表達(dá)量在硝苯地平處理組顯著降低,但NSDHL、SDLE、ACAT2的表達(dá)量在硝苯地平組較對(duì)照組無顯著差異。結(jié)論1.比較對(duì)照組與硝苯地平處理組轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果發(fā)現(xiàn),醛固酮瘤細(xì)胞出現(xiàn)40個(gè)表達(dá)量高且有表達(dá)差異的基因。2.首次發(fā)現(xiàn)硝苯地平能抑制HMGCS1的表達(dá)。3.首次發(fā)現(xiàn)APA細(xì)胞表達(dá)多種合成膽固醇的基因。第四部分貝尼地平和硝苯地平對(duì)原醛患者醛固酮水平影響目的本研究組的工作證實(shí)在原代培養(yǎng)中,鈣通道阻滯劑能顯著抑制醛固酮的合成,且貝尼地平較硝苯地平有更強(qiáng)的抑制趨勢(shì)。鈣通道阻滯劑對(duì)醛固酮分泌的影響的臨床研究少,且無貝尼地平在原醛患者中的臨床研究,本部分?jǐn)M研究L/T型鈣通道阻滯劑和L型鈣通道阻滯劑對(duì)原醛患者血漿醛固酮水平的影響。方法1.研究對(duì)象包括:特發(fā)性醛固酮增多癥患者2例、醛固酮瘤患者11例、家族性原醛癥-Ⅲ型(FH-Ⅲ)1例。2.停用影響醛固酮腎素活性比值的藥物,服用哌唑嗪降壓治療,服用氯化鉀補(bǔ)鉀治療。3.測(cè)定患者不服藥日、口服1OmgL型鈣通道阻滯劑硝苯地平日、口服8mgL/T型鈣通道阻滯劑貝尼地平日的8點(diǎn)(服藥前)、10點(diǎn)(服藥后2h)的外周血醛固酮、腎素活性、皮質(zhì)醇、血鉀、血鈉等生化水平。試驗(yàn)過程一直保持坐位,每隔15min測(cè)定血壓一次。4.對(duì)有腫瘤組織標(biāo)本的患者測(cè)定醛固酮瘤體系熱點(diǎn)突變。結(jié)果1.貝尼地平能顯著降低醛固酮水平,硝苯地平對(duì)醛固酮水平無顯著影響。2.貝尼地平、硝苯地平均能顯著降低原醛患者的血壓水平。3.8例手術(shù)的原醛患者均存在KCNJ5基因突變,分別為p.E145Q(N=3)、p.G151R(N=2)、p.L168R(N=2)、p.I157_E159del(N=1)。結(jié)論首次觀察了貝尼地平對(duì)原醛癥患者血漿醛固酮水平的影響。單次口服8mg貝尼地平能顯著降低醛固酮水平,單次口服10mg硝苯地平對(duì)醛固酮水平無顯著影響。因此,貝尼地平用于原醛患者的降壓治療的同時(shí)有望降低患者的醛固酮水平。第五部分64例Gitelman綜合征患者表型和基因型分析目的總結(jié)Gitelman綜合征的臨床及基因特點(diǎn),提高對(duì)該病的認(rèn)識(shí)和診治。方法回顧性分析了北京協(xié)和醫(yī)院2012至2016年診斷的64例Gitelman綜合征患者的臨床和基因特點(diǎn)。結(jié)果1.64例患者中男性患者39例,女性患者25例。初診時(shí)年齡(35± 14)歲,血鉀(2.86±0.44)mmol/L,同步 24 h 尿鉀(82.27 ± 39.73)mmol/d,血鎂(0.62±0.14)mmol/L,24h 尿鈣(0.94±0.83)mmol/d,平均血壓為 110/69mmHg。2.64例患者的基因突變散在分布于SLC12A3基因,40例患者為復(fù)合雜合突變,10例患者為單雜合突變,9例患者為多雜合突變,5例患者為純合突變;復(fù)合雜合突變者初診時(shí)血鉀水平較高(P0.05)。3.64例患者共檢出74種不同的突變類型,32%的位點(diǎn)為新發(fā)突變(24/74)。p.Asp486Asn是最常見的突變位點(diǎn),見于25%(16/64)的患者。結(jié)論Gitelman綜合征患者的基因型和表型異質(zhì)性很大,復(fù)合雜合突變患者的臨床表型相對(duì)較輕。p.Asp486Asn是本研究中的熱點(diǎn)突變。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R586.24
【圖文】：

邐中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文邐逡逑結(jié)果逡逑１．原代培養(yǎng)的ＡＰＡ細(xì)胞形態(tài)逡逑共對(duì)６個(gè)ＡＰＡ進(jìn)行了原代培養(yǎng)，并培養(yǎng)３個(gè)無功能瘤和３個(gè)皮質(zhì)醇瘤的原代逡逑細(xì)胞以進(jìn)行對(duì)比觀察。ＡＰＡ組織和無功能瘤組織呈金黃色，皮質(zhì)醇瘤組織呈黃褐逡逑色。ＡＰＡ細(xì)胞培養(yǎng)２４ｈ，細(xì)胞基本貼壁，大部分細(xì)胞為圓形；７２ｈ后，細(xì)胞貼壁更逡逑牢固并伸展，少部分呈三角形或不規(guī)則形。細(xì)胞分為兩種形態(tài)，一種細(xì)胞質(zhì)透逡逑明，另外一種細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色。無功能瘤的細(xì)胞形態(tài)與ＡＰＡ細(xì)胞相近。皮質(zhì)醇瘤逡逑細(xì)胞胞質(zhì)較清亮（圖１－１）。逡逑

３．原代培養(yǎng)的ＡＰＡ細(xì)胞中存在ＣＹＰ１１Ｂ２表達(dá)逡逑原代培養(yǎng)的ＡＰＡ細(xì)胞中ＣＹＰ１１Ｂ２免疫熒光陽性，說明該培養(yǎng)細(xì)胞存在醛固酮逡逑合成酶（見圖１－３）。逡逑圖１－３邋培養(yǎng)第５天的ＡＰＡ細(xì)胞的免疫熒光融合圖像；藍(lán)色熒光為ＤＡＰＩ染色（ｘｌＯＯ），逡逑紅色熒光為ＣＹＰ１１Ｂ２染色（ｘｌ00）逡逑１９逡逑

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本文編號(hào)：2732551