【摘要】：研究背景隨著科技進(jìn)步,人們生活水平的提高,糖尿病已成為威脅人類健康的一個(gè)嚴(yán)重的全球性衛(wèi)生問題。大型流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,糖尿病與年齡密切相關(guān),好發(fā)于老年人,尤其是60歲以上老年人患病率較高。近年來,關(guān)于胰島β細(xì)胞衰老在糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用備受關(guān)注,清除衰老細(xì)胞和改善衰老細(xì)胞的微環(huán)境有望成為糖尿病治療方式之一。研究表明,細(xì)胞衰老分為復(fù)制性衰老和應(yīng)激性衰老,氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞衰老的重要原因之一。在氧化應(yīng)激過程中,硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)作為一種在細(xì)胞中廣泛存在的氧化還原酶,可以減少氧化蛋白,清除自由基。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)是唯一的Trx內(nèi)源性結(jié)合抑制蛋白,抑制Trx活性,進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。有研究表明,在糖尿病患者和糖尿病模型小鼠中均觀察到胰島β細(xì)胞TXNIP的表達(dá)顯著上調(diào),且抑制TXNIP的表達(dá)可以減緩糖尿病的發(fā)生發(fā)展。細(xì)胞的增殖能力下降是細(xì)胞衰老的主要表現(xiàn),因此我們推測TXNIP在糖尿病在發(fā)生發(fā)展過程中可能存在表達(dá)增多,進(jìn)而促進(jìn)胰島β細(xì)胞衰老,減弱其增殖能力,引起β細(xì)胞更新不足,數(shù)目下降。除抑制Trx外,研究發(fā)現(xiàn),TXNIP具有阻抑蛋白特征,通過與某些關(guān)鍵蛋白的結(jié)合而調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)。因此,TXNIP的作用機(jī)制存在Trx依賴和Trx非依賴的機(jī)制。那么TXNIP又是通過什么途徑影響胰島β細(xì)胞衰老的?因此,在本研究中,我們首先觀察糖尿病鼠胰腺組織中TXNIP的表達(dá),以及衰老的變化。并利用慢病毒載體,構(gòu)建TXNIP過表達(dá)的INS-1胰島β細(xì)胞株,模擬糖尿病時(shí)TXNIP表達(dá)上調(diào),以分析TXNIP本身對胰島β細(xì)胞老化的影響;同時(shí)構(gòu)建半胱氨酸247位點(diǎn)突變的TXNIP過表達(dá)INS-1細(xì)胞株,以分析TXNIP依賴與非依賴Trx途徑對胰島β細(xì)胞衰老影響及可能存在的機(jī)制。構(gòu)建TXNIP沉默INS-1細(xì)胞株,進(jìn)一步確定TXNIP在胰島β細(xì)胞衰老過程中的作用。第一部分:糖尿病促進(jìn)胰腺TXNIP表達(dá)升高及衰老目的:糖尿病中可觀察到胰島β細(xì)胞中TXNIP表達(dá)升高,而TXNIP具有促凋亡、促炎和抑制增殖等作用。本部分旨在觀察糖尿病小鼠胰腺組織TXNIP表達(dá)的變化以及胰腺組織衰老情況。方法:1.檢測db/m、db/db小鼠空腹血糖值。2.Western blot檢測胰腺組織TXNIP蛋白以及衰老相關(guān)指標(biāo)p16,p21,Rb表達(dá)。3.β-半乳糖苷酶染色檢測胰腺組織衰老細(xì)胞數(shù)。結(jié)果:對比db/m小鼠,db/db小鼠胰腺組織TXNIP蛋白表達(dá)升高,衰老相關(guān)蛋白p16、p21、Rb表達(dá)升高,衰老陽性細(xì)胞數(shù)增多,促進(jìn)細(xì)胞衰老。結(jié)論:糖尿病小鼠中TXNIP表達(dá)上調(diào),胰腺組織衰老增加。第二部分:慢病毒轉(zhuǎn)染INS-1胰島β細(xì)胞構(gòu)建TXNIP過表達(dá)及干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株目的:在大鼠INS-1胰島β細(xì)胞中,通過慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建穩(wěn)定高效的TXNIP過表達(dá)及沉默模型。方法:1.構(gòu)建含有綠色熒光蛋白(GFP)的空慢病毒載體(Ad-GFP)、TXNIP過表達(dá)慢病毒載體(Ad-TXNIP-GFP)及TXNIP半胱氨酸247位點(diǎn)突變過表達(dá)慢病毒載體(Ad-TXNIP-c247s-GFP)。2.構(gòu)建含有紅色熒光蛋白(merry)的空慢病毒載體(Scramble Sh-RNA)和TXNIP沉默慢病毒載體(TXNIP Sh-RNA-1、TXNIP Sh-RNA-2、TXNIP Sh-RNA-3)。3.Normal組直接加入1ml RPMI 1640完全培養(yǎng)基,Ad-GFP、Ad-TXNIP-GFP、Ad-TXNIP-c247s-GFP、Scramble Sh-RNA、TXNIP Sh-RNA-1、TXNIP Sh-RNA-2、TXNIP Sh-RNA-3各組分別加入30μl對應(yīng)病毒與1ml RPMI 1640完全培養(yǎng)基的混合液。慢病毒轉(zhuǎn)染4h后,棄去含病毒的培養(yǎng)基,1ml PBS洗3次,各組分別加4ml RPMI1640完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)48h后,加入含3μg/ml嘌呤霉素(puromycin,PM)的RPMI 1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選,持續(xù)7天,每2~3天替換新的篩選培養(yǎng)基,運(yùn)用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察,當(dāng)細(xì)胞熒光率達(dá)90%以上時(shí),各組換回正常RMPI 1640完全培養(yǎng)基,穩(wěn)轉(zhuǎn)TXNIP沉默和過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功。4.熒光顯微鏡下觀察各組熒光蛋白表達(dá)情況。5.Real-time PCR檢測TXNIP m RNA表達(dá)水平。6.Western blot檢測TXNIP蛋白表達(dá)水平。7.免疫共沉淀驗(yàn)證c247s位點(diǎn)突變的TXNIP過表達(dá)能否與Trx結(jié)合。結(jié)果:1.熒光顯微鏡下觀察到穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建成功。2.與Ad-GFP組相比,Ad-TXNIP-GFP組TXNIP的m RNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.01)。3.篩選有效TXNIP沉默序列,與Scramble Sh RNA組相比,第三條干擾序列效果最佳,其TXNIP的m RNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.01)。4.半胱氨酸247位點(diǎn)突變的過表達(dá)TXNIP不能與Trx結(jié)合。結(jié)論:慢病毒載體穩(wěn)轉(zhuǎn)TXNIP過表達(dá)及沉默細(xì)胞株構(gòu)建成功。第三部分:TXNIP對INS-1胰島β細(xì)胞衰老的影響目的:觀察TXNIP上調(diào)是否可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞衰老,并探討其可能機(jī)制。方法:1.采用慢病毒構(gòu)建TXNIP過表達(dá)(Ad-TXNIP-GFP)、247位點(diǎn)半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸的TXNIP過表達(dá)(Ad-TXNIP-c247s-GFP,喪失與硫氧還蛋白Trx結(jié)合位點(diǎn))及沉默TXNIP(TXNIP Sh-RNA)穩(wěn)轉(zhuǎn)INS-1胰島β細(xì)胞株。2.β-半乳糖苷酶染色檢測細(xì)胞衰老。3.Western blot檢測衰老相關(guān)基因p16、p21、Rb蛋白表達(dá)水平。4.Western blot檢測p38 MAPK磷酸化、p53蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.TXNIP及TXNIP-c247s過表達(dá)可促進(jìn)p38 MAPK的磷酸化、p53蛋白表達(dá),TXNIP沉默可抑制p38 MAPK的磷酸化、p53蛋白表達(dá)。2.分別采用p38 MAPK抑制劑SB203580、p53抑制劑Pifithrin-β預(yù)處理細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)p38 MAPK和p53抑制劑均可抑制p21、p16、Rb的蛋白表達(dá),減輕細(xì)胞衰老,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)p38 MAPK抑制劑可抑制p53蛋白表達(dá),而p53抑制劑并不影響p38 MAPK的磷酸化。結(jié)論:TXNIP可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞衰老,其機(jī)制與TXNIP上調(diào)p21、p16、Rb蛋白表達(dá)有關(guān)。TXNIP可以通過Trx依賴途徑促進(jìn)p38 MAPK磷酸化及后續(xù)的p16、p53表達(dá)上調(diào),也可通過Trx非依賴途徑增加p53蛋白表達(dá),進(jìn)而增加p21、Rb蛋白表達(dá),從而引起INS-1細(xì)胞衰老。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.1
【圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文2 結(jié)果2.1 db/db 小鼠空腹血糖上升且胰腺組織 TXNIP 表達(dá)升高為觀察糖尿病小鼠是否構(gòu)建成功及其胰腺組織 TXNIP 表達(dá)水平的變化。我們采用血糖儀檢測小鼠空腹血糖，Western blot 檢測 TXNIP 蛋白表達(dá)。如圖 1 所示，與正常小鼠相比，db/db 小鼠空腹血糖顯著上升（圖 1A）（P<0.01），胰腺組織 TXNIP蛋白表達(dá)顯著升高（圖 1B）（P<0.05）。以上結(jié)果表明，糖尿病小鼠構(gòu)建成功，且糖尿病可使胰腺組織中 TXNIP 表達(dá)升高。

9圖 2. db/db 小鼠胰腺組織陽性衰老細(xì)胞增加及衰老相關(guān)蛋白表達(dá)升高Figure 2. Increase ofAging cells andAging related protein expression in Pancreatic tissue of db/db miceA: SA-β-gal staining in pancreas of db/db mice. scale bar, 100μm. B: p16, p21, Rb protein expressiondetected by Western blot. Mean±SEM, n=6. *P<0.05 vs db/m.

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本文編號(hào)：2729195