【摘要】：目的:探索人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液(hAMSCs-CM)對(duì)百草枯所致A549細(xì)胞損傷的作用效果及其初步機(jī)制。方法:常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞,并加入不同濃度的百草枯(PQ),采用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。采用機(jī)械-胰蛋白酶聯(lián)合的方法獲取人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs),常規(guī)培養(yǎng)并提取其培養(yǎng)上清液;加入不同濃度的hAMSCs-CM干預(yù)PQ染毒后的細(xì)胞,分為PBS組、PQ組(造模組)、PQ+hAMSCs-CM組(hAMSCs-CM干預(yù)組,根據(jù)體積分?jǐn)?shù)分為25%、50%、75%濃度)、hAMSCs-CM組(hAMSCs-CM,對(duì)應(yīng)各濃度),采用CCK-8試劑檢測(cè)其細(xì)胞增殖活力。利用倒置相差顯微鏡及透射電鏡觀察PBS組、PQ組、PQ+hAMSCs-CM組(50%濃度)、hAMSCs-CM組(50%濃度)的細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)。利用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞活性氧(ROS)的分布情況。采用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6、IL-10的含量。采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)上述各組細(xì)胞凋亡情況。采用Western blot檢測(cè)各組Bax、Bcl-2、CHOP及GRP78蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:1、250μM、500μM、750μM、1000μM終濃度的PQ染毒24h后,其細(xì)胞增殖活力下降,得出IC50的PQ濃度為816μM,后期選用750μM作為A549細(xì)胞造模濃度。2、PBS組、PQ組、PQ+hAMSCs-CM組(50%濃度)、hAMSCs-CM組(50%濃度)的細(xì)胞增殖活力分別為(99.98±4.56)%、(52.52±3.02)%、(63.18±3.97)%、(97.42±2.28)%(F=271.954,P0.01)。3、PQ染毒后,A549細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,死亡細(xì)胞及細(xì)胞碎片增多;PQ+hAMSCs-CM組上述改變較PQ組減輕。4、PQ組細(xì)胞表面微絨毛、突起減少,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹,核染色質(zhì)團(tuán)聚分布異常;PQ+hAMSCs-CM組細(xì)胞表面可見(jiàn)微絨毛,胞質(zhì)均勻,細(xì)胞器損傷減輕,核染色質(zhì)均勻。5、PQ組細(xì)胞內(nèi)ROS較PBS組增多,PQ+hAMSCs-CM組較PQ組減少。6、PQ+hAMSCs-CM組上清中IL-10的含量較PQ組高,PQ+hAMSCs-CM組IL-1β、IL-6的含量較PQ組低(均P0.01)。7、PBS組、PQ組、PQ+hAMSCs-CM組、hAMSCs-CM組的細(xì)胞早期凋亡率分別為(1.96±0.50)%、(14.16±1.15)%、(7.52±2.35)%、(1.71±0.88)%(F=44.619,P0.01)。8、PQ+hAMSCs-CM組Bax/Bcl-2比例較PQ組低(P0.05),前者CHOP的表達(dá)量較PQ組低(P0.01),兩組GRP78的表達(dá)量無(wú)差異(P0.05)。結(jié)論:1、hAMSCs-CM能減少活性氧的產(chǎn)生,減少PQ所致A549細(xì)胞的炎癥因子分泌,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的損傷。2、hAMSCs-CM可能通過(guò)減輕氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑減輕PQ所致A549細(xì)胞的損傷。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R595
【圖文】：

科大學(xué)碩士學(xué)位論文 驗(yàn)結(jié)果CCK-8 法檢測(cè) PQ 染毒后的細(xì)胞增殖活力次實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，A549 細(xì)胞經(jīng) 250μM、500μM 濃度的 PQ 染毒 24h 后，其生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，細(xì)胞增殖活＜0.01，表 4、圖 5）。計(jì)算 IC50 的 PQ 濃度為 816μM；在后期實(shí)驗(yàn) 濃度的 PQ 作為造模濃度。表 4 CCK-8 檢測(cè)不同濃度 PQ 染毒后的細(xì)胞增殖活力（ x ± s, n=6） 濃度 0μM 250μM 500μM 750μM 增殖活力 100.00 80.10 71.43 51.43 %）±5.48 ±2.78 ±1.27 ±4.45 ：上述檢測(cè)均在PQ 染毒 24h 后進(jìn)行。結(jié)果比較：F =219.270，P＜0.01。

圖 6 倒置相差顯微鏡觀察第 3 代 hAMSCs 細(xì)胞（放大倍數(shù)：100X）CK-8 法檢測(cè)hAMSCs-CM 干預(yù)后的細(xì)胞增殖活力取終濃度為 750μM 的 PQ 染毒 10min 后，加入不同濃度 hAMSCs-Ch 后檢測(cè)細(xì)胞活力，PQ+hAMSCs-CM 組細(xì)胞增殖活力均高于 PQ 組，MSCs-CM 干預(yù)劑量時(shí)細(xì)胞增殖活力最高（P＜0.01，表 5、圖7）；hAMS 組相比比較無(wú)差異。50%濃度 PQ+hAMSCs-CM 組的細(xì)胞增殖活力最期研究中，選擇 50%濃度的 hAMSCs-CM 作為干預(yù)措施。表 5 CCK-8 檢測(cè)不同濃度 hAMSCs-CM 干預(yù)后的細(xì)胞增殖活力（ x ± s, n PBS 組PQ 組(750μM)25%濃度 50%濃度 75%濃度 25%濃度 50%濃度 PQ+hAMSCs-CM 組 hAMSCs-CM 組力99.98 52.52 58.70 63.18 59.22 97.55 97.42 ±4.56 ±3.02 ±2.25*±3.97*±1.35 ±6.64 ±2.28 - - 0.003△0.000△0.002△0.477＃0.246＃

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8 戴e

本文編號(hào)：2715621